甘雅霆，周 慧，李 艷，董重實(shí)，趙 碩，閆達(dá)中,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

木聚糖酶（1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8）屬水解酶類，是將木聚糖降解為低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系。該酶在自然界的來源廣泛，諸如細(xì)菌（如枯草芽孢桿菌、黃熱芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、拜氏梭菌、耐鹽高溫雙歧菌）、真菌（如木霉、青霉、米曲霉、黑曲霉、土曲霉）、放線菌、蝸牛等[1-3]。木聚糖酶有重要的工業(yè)價(jià)值，已應(yīng)用于食品、造紙、飼料、能源和環(huán)境眾多領(lǐng)域，尤其是在食品制作和紙漿生物漂白中有著不可小覷的重要性[4]。據(jù)澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局消息，2017年7月7日澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布17-17號通報(bào)，批準(zhǔn)一種木聚糖酶作為加工助劑用于谷物食品生產(chǎn)。據(jù)了解，2017年1月23日，Puratos NV公司提交A1125號申請，申請木聚糖酶作為內(nèi)切酶使用于谷物產(chǎn)品生產(chǎn)并提交相應(yīng)草案。該木聚糖酶由轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌產(chǎn)生。它能催化阿拉伯木聚糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯木聚糖寡糖，提高這些多糖的功能特性，取得更好或更穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量，可用于面包、餅干、蛋糕等烘培食品，還有面食、面條、小吃等谷物產(chǎn)品[5]。此外，木聚糖酶在紙漿漂白中取代毒性化學(xué)物質(zhì)的同時(shí)通過酶法預(yù)處理還能有效回收副產(chǎn)物，降低化學(xué)漂白劑用量，改善漂白效果，具有良好的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益。

不同來源的木聚糖酶最適pH值不同，真菌接近于酸性，大部分放線菌和細(xì)菌接近于中性。最適反應(yīng)溫度大多在50～60 ℃左右，大大制約了木聚糖酶在工業(yè)中高溫高堿環(huán)境下的應(yīng)用[6]。由于來源于細(xì)菌的木聚糖酶的耐堿性和熱穩(wěn)定性方面要優(yōu)于真菌和放線菌，所以成為目前工業(yè)用木聚糖酶的研究熱點(diǎn)[4,7]。本研究從造紙廠的活性污泥中分離篩選產(chǎn)堿性木聚糖酶的菌株，并對1 株高產(chǎn)酶菌進(jìn)行鑒定，以期為細(xì)菌木聚糖酶的研究和工業(yè)化應(yīng)用提供細(xì)菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從武漢漢陽晨鳴造紙廠的活性污泥和污水排放口附近的泥土中分別多點(diǎn)采樣。

1.1.2 試劑

樺木木聚糖 美國Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純） 溴百里酚藍(lán)、結(jié)晶紫、番紅、醋酸鉛濾紙以及其他化學(xué)試劑（均為分析純） 中國醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑公司；dNTP Mix、Taq酶 寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 引物

引物均購自生工生物工程（武漢）有限公司。正向引物27F（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）；反向引物1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。

1.1.4 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：木聚糖1 g/L，硝酸鉀1 g/L，氯化鈉0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸銨0.3 g/L，pH 8.5。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加20 g/L瓊脂粉。種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 8.5?；A(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：木聚糖1 g/L，酵母膏2 g/L，玉米漿5 mL/L，硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，pH 8.5。復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g/L，酵母粉4 g/L，玉米漿15 mL/L，硫酸鎂1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，氯化鈣15 g/L，pH 8。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7。

1.2 儀器與設(shè)備

LAMBDA? 25 Series紫外-可見分光光度計(jì)美國PerkinElmer公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離

分別稱取活性污泥10 g，接種于250 mL液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于170 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。取5 mL培養(yǎng)物接入液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，重復(fù)3 次。取最終培養(yǎng)物稀釋成不同濃度梯度，在10-6～10-8梯度取稀釋菌液0.2 mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板，入培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)，挑取透明圈較大并具有細(xì)菌形態(tài)的單菌落進(jìn)行分離、純化，直至得到均勻的單菌，于1 mL 20%甘油的LB培養(yǎng)基中-20 ℃保藏。

1.3.2 高產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

初篩：從分離得到的7 株單菌落分別接入150 mL的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h。分別取100 μL培養(yǎng)物接種到100 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，加入0.01 g/L木聚糖溶液3 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，測定波長600 nm處的光密度（OD600nm），同時(shí)將發(fā)酵液6 000 r/min離心，取粗酶液，測其酶活力。

復(fù)篩：對7 株中酶活力最高的1號菌株，命名為YD01，進(jìn)行無機(jī)鹽平板涂布培養(yǎng)，隨機(jī)挑3 個(gè)單菌落分別接種于50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，至OD600nm達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入0.01 g/L木聚糖溶液3 mL，12 h后取1 mL菌液接種200 mL復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基于28 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取上清粗酶液，測其酶活力。

1.3.3 DNS定糖法測定木聚糖酶活力[8]

取0.5 mL稀釋粗酶液入試管，加入1.0 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液，搖勻，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入2.5 mL DNS試劑搖勻后沸水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后加入8.5 mL蒸餾水定容到12.5 mL，搖勻，測定波長540 nm處OD值。每組3 次重復(fù)，取其平均值。空白對照組則預(yù)先將酶加熱失活處理，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。將每分鐘生成1 μmol還原糖（以木糖計(jì)）所需酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。還原糖（木糖）標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.710 0x-0.111 5，R2=0.994 9。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：E為樣品酶活力/U；D為稀釋倍數(shù)（200）；A為酶液反應(yīng)的OD值；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；I為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；M為木糖的分子質(zhì)量（150.13 Da）；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.4 菌種培養(yǎng)及形態(tài)特征鑒定

將YD01菌液劃線于LB平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、水溶性色素等特征，進(jìn)行革蘭氏染色[9]。

1.3.5 菌落PCR擴(kuò)增及16S rRNA測序

將YD01菌液劃線于無機(jī)鹽平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，煮沸法提取基因組RNA。采用細(xì)菌通用引物27F和1492R PCR擴(kuò)增16S rRNA。PCR擴(kuò)增體系50 μL，包括ddH2O 37.5 μL，PCR Buffer（10×）5 μL，引物P1（27F）、P2（1492R）各1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，Taq酶（含Mg2+）0.5 μL，模板4 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工武漢測序部測序。測序結(jié)果提交GenBank（Accession Number：MF443454），進(jìn)行BLAST比對分析，利用Clustal W和MEGA 6.05軟件進(jìn)行分析，Neighbor-Joinning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 生理生化鑒定分析

糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，H2S實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，加熱存活實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照微桿菌屬不同種的特征確定YD01的菌種[10]。

1.3.7 木聚糖酶最適pH值、最適溫度測定

配制pH值分別為6.0～10.0的Na2HPO4-NaH2PO4和甘氨酸-NaOH緩沖液，將粗酶液加到相應(yīng)pH值buffer，按照1.3.3節(jié)測定50 ℃酶活力。以相同方法在溫度分別為40、50、60、70、80 ℃條件下測定pH 8.0的酶活力。1.3.8 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性測定

將粗酶液分別加到pH值為6.0～10.0的緩沖體系中保持1 h后同法測定50 ℃酶活力，以其最適溫度對應(yīng)的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。將粗酶液分別置于40、50、60、70、80 ℃保溫1 h后，同法測定pH 8.0的酶活力，以其最適pH值對應(yīng)的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以 ±s表示，應(yīng)用Origin 8.5軟件進(jìn)行擬合分析，Excel 2007軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平選取P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離

圖1 產(chǎn)酶菌株在平板上形成的透明圈Fig. 1 Transparent halos around the colonies with xylanase activity on the plate

經(jīng)過3 次連續(xù)傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)物稀釋涂布無機(jī)鹽平板，得到均勻、水解圈較大且透明的單菌落（圖1）。

2.2 高產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

2.2.1 初篩菌株生長情況測定結(jié)果

挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株共7 株。按1.3.2節(jié)方法培養(yǎng)后測定酶液在波長為600 nm處的光密度（圖2）。7 株中生長情況最好的1號菌株，酶活力亦為最高，命名為YD01。

圖2 不同初篩菌株的24 h培養(yǎng)物的OD600 nmFig. 2 OD600 nm of cultures of 7 isolates after 24 h incubation.

2.2.2 復(fù)篩菌株酶活力測定結(jié)果

將YD01進(jìn)行無機(jī)鹽平板涂布培養(yǎng)后隨機(jī)挑3 個(gè)單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后測酶活力（圖3），酶活力最高為36.85 U/mL。

圖3 復(fù)篩菌株酶活力Fig. 3 Xylanase activity of selected strains

2.3 菌株鑒定

2.3.1 YD01菌落形態(tài)

菌落呈桿狀、較濕潤、較光滑、較黏稠、易挑起、質(zhì)地均勻、菌落正反面及中央部位的顏色一致。

2.3.2 菌株的革蘭氏染色

以革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為對照，對YD01進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果為紫色（圖4），表明YD01為革蘭氏陽性菌。

圖4 革蘭氏染色（40×10）Fig. 4 Gram staining (40 × 10)

2.3.3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測及16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，電泳檢測基因序列長度約1 433 bp（圖5）。

圖5 YD01的16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of 16S rRNA PCR products amplified from strain YD01

PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳回收后送生工測序，經(jīng)BLAST同源分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），它顯示了YD01菌和微桿菌屬其他種菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。根據(jù)同源性遠(yuǎn)近，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹、菌落形態(tài)、顏色及革蘭氏染色結(jié)果確定菌屬，該菌為微桿菌屬（Microbacterium）。

圖6 菌株YD01的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap value 1 000）Fig. 6 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain YD01

2.3.4 生理生化鑒定

表1 菌株YD01的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YD01

如表1所示，菌株YD01的葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；H2S實(shí)驗(yàn)陽性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性；37 ℃加熱能存活；能運(yùn)動(dòng)。

2.4 木聚糖酶最適pH值和最適溫度分析

圖7 木聚糖酶最適pH值（A）與最適溫度（B）Fig. 7 Optimum pH (A) and optimum temperature (B) for the xylanase

如圖7所示，木聚糖酶最適作用pH值為8.0，最適作用溫度為50 ℃。pH 10和80 ℃時(shí)，仍有87%和85%的剩余酶活力。

2.5 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性分析

圖8 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性（A）與溫度穩(wěn)定性（B）Fig. 8 pH stability (A) and temperature stability (B) for the xylanase

如圖8所示，不同pH值保持1 h后的木聚糖酶在最適pH 8.0時(shí)有80.83%的相對酶活力，在pH 10時(shí)仍有41.43%的相對酶活力。保溫1 h后的木聚糖酶在最適作用溫度50 ℃時(shí)有62.33%的相對酶活力，在80℃時(shí)仍有56.82%的相對酶活力，表明YD01所產(chǎn)木聚糖酶具備較好的耐堿性和耐高溫能力。

3 討 論

經(jīng)革蘭氏染色、16S rRNA序列分析，確定YD01為微桿菌屬。生理生化結(jié)果則為葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖發(fā)酵陽性；產(chǎn)H2S陽性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性；37 ℃加熱能存活，能運(yùn)動(dòng)；文獻(xiàn)[10]表明微桿菌屬僅有31 種，而高艷秀等[11]研究結(jié)果報(bào)道微桿菌屬共有34 個(gè)種，另外3 個(gè)種分別為M. paraoxydans、M. aerolatum、M. gubbeenense，因M. paraoxydans產(chǎn)H2S陰性[12]，M. aerolatum不能利用L-阿拉伯糖[13]，M. gubbeenense不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖產(chǎn)酸[14]，不同于本研究的菌株YD01生理生化特征。通過BLAST程序比對后，顯示同源性較高的菌株中并無M.imperial，而同源性高的M. trichothecerolyticum則在37 ℃下不能存活、不能利用阿拉伯糖、不能運(yùn)動(dòng)，M. hominis則不能利用木糖、不能運(yùn)動(dòng)，與生理生化特征鑒定結(jié)果相悖。可見16S rRNA序列同源性分析結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果存在部分差異，尚不能十分準(zhǔn)確地將YD01菌鑒定至種，于是本研究結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定該菌株為微桿菌屬蛾微桿菌M. imperiale。

我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可用于面粉面食的酶制劑有淀粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等[15]。實(shí)驗(yàn)證明，在面粉中添加木聚糖酶，能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶，改進(jìn)面團(tuán)的機(jī)械強(qiáng)度和增加面包的體積，改進(jìn)面包的色澤。我國成功研發(fā)了內(nèi)切木聚糖酶，它可以使阿拉伯木聚糖水解成為水溶性的寡糖，其水解率達(dá)65%，產(chǎn)生以木二糖、木三糖為主的低聚糖混合物。這種低聚木糖甜味純正，耐高溫不分解，pH值穩(wěn)定性好，有利于雙歧桿菌增殖，對改善腸道功能增進(jìn)健康有明顯效果。假如面粉中阿拉伯木聚糖為2%，其中有1.5%的不溶性阿拉伯木聚糖，經(jīng)內(nèi)切木聚糖酶水解50%，則有0.75%的低聚木糖。即每100 g的面食中，就有0.75 g的低聚木糖，這正好是攝入的有效劑量。這樣就做到了以主食為載體的低聚木糖功能食品。Chapla等[16]使用來自臭曲霉MTCC 4898的部分純化的木聚糖酶進(jìn)行選擇性生產(chǎn)低聚木糖。在45 ℃下用20 U木聚糖酶的反應(yīng)8 h后，木寡糖的最大產(chǎn)量為（6.73±0.23） mg/mL。Rajagopalan等[17]利用梭菌BOH3純化的木聚糖酶從堿預(yù)處理的紅木和芒果木屑中生產(chǎn)益生元-低聚木糖。Nieto-Domínguez等[18]研究了新型真菌GH11木聚糖酶對樺木木聚糖制備的低聚木糖的益生元效應(yīng)，通過分析母乳喂養(yǎng)兒童糞便發(fā)酵中微生物組成和有機(jī)酸分布的變化，即乙酸和乳酸的驟增，潛在致病菌的減少和雙歧桿菌的增加，以及可能的有益共生物，證實(shí)了這些低聚木糖的益生元價(jià)值。Jagtap等[19]使用來自農(nóng)業(yè)廢棄物的粗微生物酶生產(chǎn)低聚木糖，無需預(yù)處理，在12 h后獲得1%的低聚木糖并且可能作為營養(yǎng)保健品應(yīng)用。木聚糖酶在眾多領(lǐng)域充分顯示了它廣闊的應(yīng)用前景，但由于存在著經(jīng)濟(jì)性、穩(wěn)定性、使用效率等各方面的問題，木聚糖酶大規(guī)模投入工業(yè)應(yīng)用還有待努力。目前國內(nèi)外很多研究團(tuán)隊(duì)篩選到一些產(chǎn)酶微生物。包怡紅等[20]以木聚糖為唯一碳源，從富含半纖維素的土壤生境采樣，分離、純化、酶活測定后，經(jīng)16S rRNA鑒定其為類芽孢桿菌，最適pH值為5，最適溫度為50 ℃；梁芳芳等[21]經(jīng)富集培養(yǎng)與透明平板篩選的方法得到透明圈最大的木聚糖酶產(chǎn)生菌X7，經(jīng)鑒定其為枯草芽孢桿菌，最適pH值為6，最適溫度為55 ℃；騰超等[22]從土樣中篩選得到高產(chǎn)木聚糖酶霉菌，經(jīng)菌體形態(tài)觀察、菌落培養(yǎng)特征與18S rRNA序列同源性比對等分析，鑒定該菌為嗜熱踝節(jié)菌；李里特等[23]以木聚糖為唯一碳源篩選出1 株木聚糖酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)菌落特征、生理生化特征和細(xì)胞壁化學(xué)組分分析等試驗(yàn)鑒定該菌為卷須鏈霉菌，最適pH值為6.0；He Haiyan等[24]利用甘蔗渣為底物培養(yǎng)米曲霉HML366所產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度為65 ℃，最適pH值為6.0；Mander等[25]以麥麩為底物培養(yǎng)鏈霉菌屬CS624所產(chǎn)木聚糖酶最適溫度為60 ℃，最適pH值為6.0；Walia等[26]發(fā)現(xiàn)纖維化纖維微細(xì)菌所產(chǎn)木聚糖酶最適溫度為55 ℃，最適pH值為8.0。Wu He等[27]以甘蔗渣半纖維素為碳源，通過灰色鏈霉菌LH-3產(chǎn)生的胞外熱穩(wěn)定木聚糖酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，最適pH值為5.0，最適溫度60 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的活性。

但這些菌株所產(chǎn)的木聚糖酶仍然存在缺陷，不能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。要著力研發(fā)耐酸堿性、熱穩(wěn)定性好的木聚糖酶。本次鑒定出產(chǎn)堿性木聚糖酶細(xì)菌——蛾微桿菌M. imperiale，還鮮見報(bào)道，菌株YD01所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為8.0，最適溫度為50 ℃；在pH 10時(shí)，仍有87%剩余酶活力，在80 ℃時(shí)，亦可達(dá)85%剩余酶活力，具有較好的耐堿性及熱穩(wěn)定性，有運(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

對木聚糖酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變和固定化等方法來改善木聚糖酶學(xué)性質(zhì)，使木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)滿足應(yīng)用需求[2]。Li Fei等[28]對來自黑曲霉的木聚糖酶基因進(jìn)行堿性pH值定點(diǎn)突變改造，突變體XynB-117，與野生型酶相比，提高了相當(dāng)于初始的0.5 個(gè)pH值單位。Ribeiro等[29]將木聚糖酶插入到木糖結(jié)合蛋白中，發(fā)現(xiàn)有木糖存在時(shí)，酶活性提高了20%，原始的酶活性則被抑制。李同彪等[30]通過在黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋催化活性中心位點(diǎn)處引入疏水性氨基酸，從而使酶的熱穩(wěn)定性大幅提高。Wickramasinghe等[31]通過對從局部分離的木霉屬物種克隆EXNI基因進(jìn)行克隆和異源胞外表達(dá)，從而基因修飾樹干畢赤酵母菌（Pichia stipitis），將木聚糖水解成木寡糖。使用pGAPZα表達(dá)載體將樹干畢赤酵母工程化以攜帶Trichoderma virens的EXNI基因。本研究有助于挖掘我國堿性木聚糖酶細(xì)菌資源，為進(jìn)一步構(gòu)建工程菌提高木聚糖酶表達(dá)水平以及利用定點(diǎn)突變技術(shù)改善酶學(xué)性質(zhì)提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

以木聚糖為唯一碳源，從造紙廠活性污泥中篩選1 株高產(chǎn)堿性木聚糖酶細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)，生理、生化特征以及序列分析鑒定為微桿菌屬蛾微桿菌（M. imperiale）。酶學(xué)性質(zhì)表明，該菌株所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為8.0，最適溫度為50 ℃；在pH 10時(shí)，仍有87%剩余酶活力，在80 ℃時(shí)，亦可達(dá)85%剩余酶活力，具有較好的堿耐受性及熱穩(wěn)定性，最終發(fā)酵產(chǎn)酶水平為36.85 U/mL。