王海梅，李盈盈，侯俊財,*，姜成剛，李東飛，盧佳音，趙悅含，逄詩玥

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001）

抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為治療感染性疾病提供了非常有效的途徑，也促進了畜牧業(yè)快速發(fā)展。盡管目前抗生素治療仍然是應(yīng)對人類及動物微生物感染的首選方法，但是，由于人類長期濫用抗生素，導致其耐藥性和藥物殘留等問題日益嚴重[1]。因此，研發(fā)出廣譜高效、不易產(chǎn)生耐藥性、低殘留的新型抗菌劑成為目前的研究重點[2]，而抗菌肽是最有可能的選擇之一?？咕氖且活惿矬w中普遍存在并具有廣譜抗微生物活性的小分子肽（10～50 個氨基酸），是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有廣譜抗菌性[3-4]。抗菌肽通過膜裂解機制抑殺細菌，不易產(chǎn)生耐藥性，且組成它們的氨基酸經(jīng)過新陳代謝被吸收利用，不易殘留。但是，大多數(shù)天然抗菌肽體外活性不高，生產(chǎn)成本較高，對真核細胞有一定的毒性。為解決上述問題，對天然抗菌肽進行改造或人工設(shè)計無疑是最佳的選擇。

牛乳鐵蛋白肽（L f c i n B）來源于牛乳鐵蛋白，是一種由2 5 個氨基酸殘基（FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NH2）組成的含有一個二硫鍵的環(huán)形抗菌肽。雖然LfcinB的抑菌性顯著優(yōu)于其他來源的乳鐵蛋白肽，但是，與抗生素相比LfcinB的抑菌性還是不夠理想。LfcinB的片段LfcinB18-28（KCRRWQWRMKK-NH2）僅含有11 個氨基酸殘基，不僅保留其抑菌性，而且無溶血性，是抗菌肽分子設(shè)計的理想模板。因此，本研究借鑒小分子陽離子抗菌肽的設(shè)計理念，以LfcinB18-28為母肽，在保留其高電荷、高疏水性優(yōu)點的基礎(chǔ)上，依據(jù)對稱結(jié)構(gòu)的設(shè)計理念，引入氨基酸精氨酸（R）和色氨酸（W）替換，設(shè)計出同樣含11 個氨基酸殘基的新型牛乳鐵蛋白衍生肽KWRRWQWRRWK-NH2（KW-WK），以期提高LfcinB18-28的抑菌性和穩(wěn)定性、減少其毒性和溶血性，從而得到更有指導性的設(shè)計方法和更具有應(yīng)用潛力的新型抗菌肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗菌肽KW-WK和LFcinB18-28均由上海吉爾（GL）生化有限公司合成，合成后經(jīng)反向高效液相色譜儀純化和電噴霧質(zhì)譜儀鑒定，合成的肽用無菌蒸餾水溶解，使其濃度為2.56 mmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗所用菌株大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922）、大腸桿菌（E. coli UB1005）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 29213）、金黃色葡萄球菌（S. aureus ATCC 25923）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis ATCC 12228）、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes CMCC 54004）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium C 7 7-3 1）、鼠傷寒沙門菌（S. t y p h i m u r i u m ATCC14028）、雞白痢沙門菌（S. typhimurium C79-13）、沙門菌（S. enterica subsp. enterica CMCC 50071），均為中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。實驗所用人腎上皮293細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K美國Sigma公司；噻唑藍（thiazolylblue，MTT）、三氟乙醇（trifluoroethanol，TFE）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Biosharp公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-1320型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；721型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ZHWY-211D搖床振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 北京市永元明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分子特性的預(yù)測

抗菌肽的理論分子質(zhì)量和凈電荷通過http://web.expasy.org/compute_pi/預(yù)測，疏水性和疏水力矩通過http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/預(yù)測。

1.3.2 二級結(jié)構(gòu)的測定

抗菌肽KW-WK和LFcinB18-28的二級結(jié)構(gòu)采用圓二色譜法進行測定[5]。將肽溶解在10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、50% TFE溶液、30 mmol/L SDS溶液中，使其終濃度為60 μmol/L，分別模擬水環(huán)境、生物膜的疏水環(huán)境、帶負電荷的原核細胞膜環(huán)境，然后用圓二色譜儀對樣品溶液進行測定。

1.3.3 菌種的培養(yǎng)

將凍存于-20 ℃的待測菌株活化兩代后，劃線接種于瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，挑取單菌落，接種于20 mL無菌肉湯培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按2%接種量接于10 mL新鮮肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～4 h，至菌體處于對數(shù)生長期，調(diào)整菌體濃度為1×105CFU/mL，備用。

1.3.4 抑菌活性的測定

參考Libardo等[6]的方法。在96 孔板中，采用2 倍系列梯度法用牛血清蛋白（albumin from bovine serum，BSA）溶液倍比稀釋抗菌肽溶液，第1號孔中加10 μL待測肽溶液，90 μL BSA溶液，倍比稀釋到第10號孔，并接入50 μL的菌液。第11號孔加菌液不加肽為陽性對照，第12號孔不加肽和菌液為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)18～24 h，無肉眼可見菌體生長的最低濃度即為該肽的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.5 溶血活性的測定

參考Stark等[7]的方法。取1 mL人的新鮮血液，1 000×g離心10 min后，收集紅細胞，用PBS洗滌3 次，然后用10 mL PBS重懸細胞。在96 孔板的前10 個孔中，用PBS將肽分別稀釋為1.3.4節(jié)所述的濃度，并加入50 μL紅細胞懸液。第11號孔加入50 μL紅細胞懸液和50 μL 0.01% Triton X-100作為陽性對照，第12號孔加入50 μL的紅細胞懸液和50 μL PBS作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)1 h后取出，4 ℃、1 000×g離心10 min，再將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的96 孔板對應(yīng)的孔中，用酶標儀于波長570 nm處測吸光度。按下式計算溶血率：

式中：A為抗菌肽樣品處理組的吸光度；At為陽性對照組的吸光度；A0為陰性對照組的吸光度。

1.3.6 細胞毒性的測定

采用MTT法，MTT溶液和腎上皮293懸液的制備按照Schmidtchen等[8]的方法。按照1.3.4節(jié)方法稀釋肽。第11號孔加細胞不加肽為陽性對照，第12號孔不加細胞和肽為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加40 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，加150 μL的二甲亞砜溶液，低速振蕩10 min，用酶標儀測波長492 nm處的吸光度。

1.3.7 穩(wěn)定性的測定

抗菌肽的穩(wěn)定性測定主要包括熱穩(wěn)定性、鹽穩(wěn)定性、酶穩(wěn)定性等。選取大腸桿菌ATCC 25922為實驗菌株，未經(jīng)高溫、鹽離子、蛋白酶等處理的抗菌肽為對照組。

1.3.7.1 熱穩(wěn)定性的測定

抗菌肽在100 ℃加熱1 h，然后測定MIC。

1.3.7.2 鹽穩(wěn)定性的測定

分別配制7 種含不同鹽離子（NaCl、KCl、NH4Cl、MgCl2、ZnCl2、CaCl2、FeCl3）濃度的MHB培養(yǎng)基，待高溫滅菌后用該含鹽培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為1×105CFU/mL。然后，按照1.3.4節(jié)方法稀釋抗菌肽，加入該含鹽菌液，并使96 孔板中7 種鹽離子的終濃度分別為NaCl 150 mmol/L、KCl 4.5 mmol/L、NH4Cl 6 μmol/L、MgCl21 mmol/L、ZnCl28 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、FeCl34 mmol/L，測定抗菌肽的MIC。

1.3.7.3 酶穩(wěn)定性的測定

在37 ℃水浴條件下，用反應(yīng)終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K溶液分別處理抗菌肽1 h，然后測定其MIC。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個待測樣品均重復3 次，用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，之后采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 KW-WK和LFcinB18-28的分子特性

表1 KW-WK抗菌肽和LFcinB18-28的分子特性Table 1 Characterization of KW-WK peptide and LFcinB18-28

如表1所示，KW-WK和LFcinB18-28的實際分子質(zhì)量（分別為1 171.13、1 605.2 Da）與理論分子質(zhì)量（分別為1 172.1、1 605.9 Da）很接近，表明合成肽是所需要的目標肽。KW-WK較LFcinB18-28的凈電荷和疏水性相差不大，但疏水力矩有了較大的提高，表明KW-WK的兩親性有了較大的增強。

2.2 KW-WK和LFcinB18-28的二級結(jié)構(gòu)測定結(jié)果

圖1 KW-WK（A）和LFcinB18-28（B）在10 mmol/L的PBS、50% TFE和30 mmol/L SDS溶液中的圓二色譜圖Fig. 1 CD spectra of KW-WK (A) and LFcinB18-28 in (B) 10 mmol/L in sodium phosphate buffer, 50% TFE, or 30 mmol/L SDS

由圖1可知，在PBS（模擬水環(huán)境）中，2 條肽在波長200 nm附近都呈現(xiàn)一個負的特征峰，這是蛋白質(zhì)和多肽無規(guī)卷曲的典型特征[9]。在SDS溶液中，KW-WK在波長195 nm附近呈現(xiàn)出正的特征峰，在波長208 nm和222 nm處呈現(xiàn)出2 個負的特征峰，表明KW-WK在模擬細胞膜環(huán)境中，以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在[10-11]。LFcinB18-28在波長200 nm處有一個明顯的負峰，說明其在SDS溶液中為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；在TFE溶液中，LFcinB18-28在波長195～198 nm處出現(xiàn)了正的特征譜帶，在波長217～218 nm處出現(xiàn)了一個負的特征肩峰譜帶，這是β-折疊構(gòu)象的典型圖譜特征[3]。

2.3 抑菌活性測定結(jié)果

表2 KW-WK抗菌肽和LFcinB18-28的MICTable 2 MIC of KW-WK peptide and LFcinB18-28

由表2可知，KW-WK的MIC范圍為4～128 μmol/L，GM為28.00 μmol/L。其對大腸桿菌ATCC 25922的抑菌性最強，M I C為4 μ m o l/L，而對沙門菌CMCC 50071的抑菌性最弱，MIC為128 μmol/L。母肽LFcinB18-28的抑菌效果較差，除了對大腸桿菌ATCC 25922的抑菌效果強之外，對其余8 株致病菌的MIC均大于64 μmol/L，GM為200.89 μmol/L。

2.4 溶血活性測定結(jié)果

圖2 KW-WK和LFcinB18-28的溶血活性Fig. 2 Hemolytic activities of KW-WK and LFcinB18-28

由圖2可知，隨著肽濃度的增加，KW-WK的溶血率呈先上升后下降的趨勢，說明受試肽對紅細胞的溶血率呈濃度依賴性。當肽濃度在1～256 μmol/L時，2 條肽對紅細胞的溶血率始終都在5%以下，說明2 條肽的溶血性都很弱。

2.5 細胞毒性測定結(jié)果

由圖3可知，當肽濃度在0.5～256 μmol/L之間時，KW-WK和LFcinB18-28對細胞存活率影響無顯著差異（P＞0.05）。當LFcinB18-28的濃度在1～64 μmol/L之間時，細胞的存活率在95%以上，當KW-WK的濃度在1～128 μmol/L之間時，細胞的存活率依然在95%以上，表明KW-WK和LFcinB18-28的細胞毒性都很小。

圖3 KW-WK和LFcinB18-28的細胞毒性Fig. 3 Cytotoxicity of KW-WK and LFcinB18-28

2.6 穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.6.1 熱穩(wěn)定性

表3 熱處理后KW-WK和LFcinB18-28的MICTable 3 MIC of KW-WK and LFcinB18-28 after heat treatment

由表3可知，KW-WK和LFcinB18-28經(jīng)100 ℃處理1 h，MIC仍為4 μmol/L和16 μmol/L，說明2 條肽的穩(wěn)定性不受高溫影響。

2.6.2 鹽穩(wěn)定性

表4 鹽溶液處理后KW-WK和LFcinB18-28的MICTable 4 MIC of KW-WK and LFcinB18-28 in the presence of salts

由表4可知，K+、Fe3+對KW-WK的抑菌活性沒有影響，MIC仍為4 μmol/L；其他5種陽離子處理后的MIC為8 μmol/L，雖然比對照組的4 μmol/L略高，但依然保持較高的抑菌活性。Zn2+、Fe3+、NH4+能增強LFcinB18-28的抑菌活性，MIC從16 μmol/L降低到8 μmol/L或4 μmol/L，其他陽離子不影響LFcinB18-28的抑菌活性，MIC不變。從結(jié)果可以看出，2 條肽均具有較好的陽離子穩(wěn)定性。

2.6.3 酶穩(wěn)定性

表5 蛋白酶溶液處理后KW-WK和LFcinB18-28的MICTable 5 MIC of KW-WK and LFcinB18-28 after treatment with proteases

由表5可知，KW-WK經(jīng)胰蛋白酶處理后，MIC由4 μmol/L增加為128 μmol/L以上，完全失活。經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白K酶處理后MIC分別為16、8 μmol/L和8 μmol/L，雖然有所升高但依然有較好的抑菌活性。4 種蛋白酶對LFcinB18-28的抑菌活性影響很大，處理后的LFcinB18-28的MIC均大于128 μmol/L，完全失活。

3 討 論

大量研究表明，正電荷、疏水性和兩親性是決定抗菌肽生物活性的重要因素[12-13]，母肽LFcinB18-28具有較高的電荷數(shù)（+6）和較強的疏水性（0.420），但兩親性相對較弱。精氨酸和色氨酸是高效抗菌肽的重要組成部分[14-15]，精氨酸帶有正電荷，能夠有效地與細菌中帶負電荷的成分（脂多糖、磷脂等）相互作用，從而能夠較為牢靠的黏附在細菌細胞膜的表面[16]；色氨酸側(cè)鏈同時具有極性和疏水性，這使得色氨酸較易分布在親疏水的界面處，有助于將抗菌肽錨定在細胞膜的表面[16]。一些研究表明，對稱結(jié)構(gòu)能顯著提高抗菌肽的生物活性[17]。所以，本研究在LFcinB18-28高電荷、強疏水性的基礎(chǔ)上，依據(jù)對稱結(jié)構(gòu)的設(shè)計理念，引入氨基酸（精氨酸、色氨酸）替換，增強了兩親性，成功設(shè)計出新型抗菌肽KW-WK。

大量研究表明，高效抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)，以α-螺旋最多[18-20]。本實驗中2 條肽在PBS中都為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；在SDS溶液中KW-WK呈α-螺旋結(jié)構(gòu)，LFcinB18-28依然為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；在TFE溶液中LFcinB18-28為β-折疊構(gòu)象。這說明設(shè)計改造的抗菌肽KW-WK，在模擬細胞膜環(huán)境（SDS溶液）中會從無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變成α-螺旋結(jié)構(gòu)。α-螺旋中的親水側(cè)鏈和疏水側(cè)鏈分別處于螺旋的兩側(cè)，這一特殊結(jié)構(gòu)會促進生物膜和多肽片段相互作用。當抗菌肽與細菌的細胞膜結(jié)合時，α-螺旋會相互聚集，在細胞膜表面形成孔洞，造成細胞內(nèi)容物外流，細胞死亡。所以，α-螺旋結(jié)構(gòu)對抗菌肽的抑菌活性有積極的影響[21]。抑菌活性的實驗結(jié)果表明KW-WK的抑菌活性遠大于LFcinB18-28，這也在一定程度上證明α-螺旋結(jié)構(gòu)能夠增強抗菌肽的抑菌活性。LFcinB18-28為β-折疊抗菌肽，可能是因為氨基酸序列中含有一個半胱氨酸，半胱氨酸是形成β-折疊的必須氨基酸[22]

TI越大，表明抗菌劑的抗菌特異性越強，細胞選擇性越好[23]。一般認為TI大于2.00為有效低毒，TI大于3.00有臨床試用意義[24]，常用抗生素S632A、諾西肽、利巴韋林的TI分別13.61、4.8、9.35[25-27]。由抑菌活性、溶血活性和細胞毒性的結(jié)果可知，KW-WK的TI（9.14）遠大于LFcinB18-28的TI（1.28），說明KW-WK的細胞選擇性較強，更適合作為抗生素替代品、食品防腐劑和飼料添加劑等。

抗菌肽應(yīng)用于生產(chǎn)，要受到多種不穩(wěn)定因素的影響，例如高溫環(huán)境，人和動物口腔、胃、腸道內(nèi)的蛋白酶，各種陽離子等方面[28]。因此，本實驗從高溫、鹽離子、蛋白酶這3 個方面研究KW-WK和LFcinB18-28的穩(wěn)定性。2 條肽經(jīng)加熱后的抑菌活性依然很高，這與之前報道的大部分抗菌肽具有良好的熱穩(wěn)定性相一致[11]。2 條肽對不同鹽離子的穩(wěn)定性不同，但整體的鹽離子穩(wěn)定性較好，Na+、Mg2+、Ca2+等會降低KW-WK的抑菌性，這可能是因為陽離子的結(jié)合位點是革蘭陰性菌細胞膜上帶負電荷的脂多糖，而陽離子抗菌肽也是通過靜電作用與細菌細胞膜結(jié)合，兩者是競爭關(guān)系[29]。因此，增強溶液中陽離子的濃度會抑制抗菌肽與細胞膜作用，從而使抑菌性降低。KW-WK經(jīng)胰蛋白酶處理后的抑菌活性大大降低，受胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K的影響較小，這可能是由不同蛋白酶的酶切位點不同造成的。研究表明，胃蛋白酶的酶切位點是疏水性氨基酸或芳香族氨基酸[30]。木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，作用位點是精氨酸、賴氨酸和甘氨酸結(jié)合的肽鍵[30]。蛋白酶K的酶切位點具有廣泛特異性，傾向裂解脂肪族氨基酸殘基[31]。蛋白酶的酶切位點是賴氨酸和精氨酸羧基端形成的肽鍵[32-33]。KW-WK含有賴氨酸和精氨酸，因此會被胰蛋白酶切斷失活。LFcinB18-28經(jīng)4 種蛋白酶處理后抑菌活性均喪失，說明LFcinB18-28具有4 種蛋白酶的酶切位點。

4 結(jié) 論

本研究在LFcinB18-28的高電荷、強疏水性的基礎(chǔ)上，依據(jù)對稱結(jié)構(gòu)的設(shè)計理念成功設(shè)計出新型抗菌肽KWWK，結(jié)果表明，新型抗菌肽KW-WK比母肽具有更高的細胞選擇性，抑菌性好，溶血性和細胞毒性低，熱穩(wěn)定性好，抗蛋白酶酶解的能力強。證明通過氨基酸替換、增強兩親性和對稱結(jié)構(gòu)等設(shè)計理念能明顯改善抗菌肽

LFcinB18-28的生物活性，新型抗菌肽KW-WK具有作為抗生素替代品、食品防腐劑、飼料添加劑的巨大潛力。