范宏亮，趙玲玲，李 君，王勝男，朱丹實(shí)，劉 暢，韓金蓮，劉 賀,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.錦州億和豆業(yè)有限公司，遼寧 錦州 121016；3.錦州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121013；4.盤錦宋大房食品有限公司，遼寧 盤錦 124000）

食品乳狀液體系分水包油（oil in water，O/W）和油包水（water in oil，W/O）兩種類型[1]。蛋白質(zhì)、油脂、多糖是食品乳狀液體系中重要的3類生物大分子，是影響食品穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)的主要因素，分子間的相互作用，體系的乳化活性、乳化穩(wěn)定性并非這3種分子之間作用的簡單加和[2-5]。O/W型乳狀液能夠通過絮凝、聚集、交聯(lián)、分層等形式破壞整個(gè)體系的穩(wěn)定性，因此在制備O/W型乳狀液時(shí)需要加入表面活性劑，Mcclements等提出乳狀液的穩(wěn)定性可以通過添加多糖，形成“雙層”或者“逐層”涂覆微滴從而改善乳狀液的物理特性[6-7]。多糖可降低油-水界面張力，因而也降低了乳化時(shí)能量的消耗，有利于體系的乳化和乳狀液的穩(wěn)定[8]。多糖對乳狀液穩(wěn)定性的影響取決于蛋白質(zhì)與多糖之間相互作用，這種作用大部分是共價(jià)鍵作用，部分非共價(jià)鍵作用（靜電作用、疏水相互作用、氫鍵作用等）使多糖分子與蛋白分子在乳狀液分子層界面上排列緊密，乳狀液相對穩(wěn)定[9-10]。向大豆分離蛋白乳狀液中添加多糖，形成大豆分離蛋白與多糖共價(jià)復(fù)合物，其中多糖的引入是對蛋白質(zhì)的一種改性或者是對其功能性質(zhì)的強(qiáng)化，可提高蛋白質(zhì)的乳化能力、乳化穩(wěn)定性[11]。有報(bào)道稱蛋白質(zhì)與多糖的共價(jià)結(jié)合提高蛋白質(zhì)的乳化特性，增加乳狀液的黏度，乳狀液的黏度僅取決于油體積分?jǐn)?shù)，而不是油的種類[12-13]。

大豆種皮中含有豐富的果膠類多糖[14]，大豆多糖的提取屬于固液浸提過程，大豆種皮多糖與其近似[15]。國內(nèi)外關(guān)于大豆種皮多糖研究目前開展了關(guān)于提取分離和初步理化性質(zhì)分析方面工作，如Kalapatuy等[16]研究得知大豆種皮中半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%～85%，劉賀等[17-22]研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取可顯著提升多糖提取率，并研究了多糖的單糖組成等性質(zhì)，所提多糖中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)82.36%，從所帶電荷來看，一般包括中性糖組成及酸性糖組成，相對分子質(zhì)量為2.293×105～4.094×105Da，為闡明大豆果膠類多糖結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。但目前關(guān)于大豆種皮多糖-蛋白乳狀液乳化方面的研究報(bào)道較少，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，提取工藝對多糖性質(zhì)影響較大，因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察微波輔助提取工藝對以大豆種皮多糖為乳化穩(wěn)定劑的多糖-蛋白乳狀液性質(zhì)的影響規(guī)律，以期為工業(yè)化生產(chǎn)大豆種皮多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮 錦州大豆皮經(jīng)銷公司；乙醇（分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司；草酸銨（分析純）天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；NANO-ZS90 ZS-90粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；Turbiscan LAB多重光散射儀 法國Formulaction公司；OA21002型精密電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；L-535R型離心機(jī)、SL-250A型離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；SH-3型雙顯恒溫加熱磁力攪拌器 北京金紫光科技發(fā)展有限公司；SL-250A高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠；DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AR224CN型電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠；WD800G型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆種皮水溶性多糖的制備

大豆種皮水溶性多糖的提取采用課題組前期研究方法[17]，提取劑為草酸銨溶液，微波輔助萃取工藝參數(shù)的設(shè)置按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。

準(zhǔn)備材料（大豆皮）→干燥粉碎→加入乙醇溶液脫色、攪拌→過濾→濾渣干燥→取干燥后濾渣→加入萃取劑（草酸銨）溶液→微波處理→離心→取上清液→真空濃縮→調(diào)pH值→乙醇沉淀→干燥→大豆種皮多糖

1.3.2 大豆種皮水溶性多糖-蛋白乳狀液的制備

配制50 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，取40 mL，加入10 mL的大豆油。利用高速剪切機(jī)于10 000 r/min剪切1 min，制成50 mL的初級乳狀液。將大豆種皮多糖配制成60 mg/mL的水溶液，與初級乳狀液以1∶1（V/V）混合，并利用高速剪切機(jī)于10 000 r/min剪切1 min，最終使乳狀液包含10%油、2%大豆分離蛋白、3%大豆種皮多糖[21]，再加入0.02%疊氮化鈉用來抑制微生物的生長，制成的乳狀液于4 ℃貯存[23]。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

參考劉賀等[17]微波輔助提取大豆種皮果膠工藝，結(jié)合本課題組前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)，篩選出顯著影響乳狀液性質(zhì)的大豆種皮多糖提取工藝的因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[24]，以所提取多糖制備乳狀液的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）、Zeta電位絕對值為指標(biāo)，確定乳狀液相關(guān)性質(zhì)最佳的工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.4 乳狀液EAI的測定

用微量取樣器取出底部的乳狀液5 0 μ L，用0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液稀釋到一定倍數(shù)后放入比色皿中，以相同的十二烷基硫酸鈉溶液作參比液，立即測定其在500 nm波長處的吸光度A。根據(jù)趙國華等[25]的方法進(jìn)行簡化，乳化活性用EAI表示，見式（1）[26]：

1.3.5 乳狀液Zeta電位的測定

利用NANO ZS90激光粒度分布儀測定乳狀液的Zeta電位，取1 mL稀釋10 倍的乳狀液于樣品池中，在20 ℃條件下進(jìn)行Zeta電位測定[27]。根據(jù)布朗運(yùn)動(dòng)理論計(jì)算電泳遷移（μep），見式（2）：

式中：v為液滴速率/（m/s）；E代表外加電場/V。

應(yīng)用Henry關(guān)系計(jì)算出Zeta電位，見式（3）：

式中：ε為液體介電常數(shù)；η為黏度/（Pa·s）；ζ為Zeta電位值/mV；f（ka）為Henry函數(shù)。

1.3.6 多重光散射儀對乳狀液穩(wěn)定性分析

采用Turbiscan LAB多重光散射儀對乳狀液進(jìn)行掃描，可得到不同響應(yīng)值隨時(shí)間變化的曲線[28]。穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）是通過累計(jì)樣品所有高度處前后兩次掃描測量的光強(qiáng)度變化值，得到樣品穩(wěn)定性的評價(jià)指標(biāo)，見式（4）[29-32]。對乳狀液進(jìn)行掃描，間隔1 min，共掃描20 min，進(jìn)行TSI對比。

式中：h為掃描點(diǎn)高度/mm；H為樣品總高度/mm；|scani（h）-scani-1（h）|為h高度處相鄰兩次掃描點(diǎn)光強(qiáng)度變化絕對值。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

以EAI、Zeta電位絕對值為指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平設(shè)計(jì)，篩選影響響應(yīng)值的主要因素。如表2所示，不同條件下EAI為37.26～46.15 m2/g，Zeta電位絕對值在22.5～36.8 mV之間，均優(yōu)于大豆分離蛋白空白對照乳狀液（EAI為16.31 m2/g，Zeta電位絕對值為21.5 mV）。根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、4。EAI數(shù)學(xué)回歸模型為EAI=45.32+1.26A+1.03B-0.56C-0.15AB-0.035AC+1.58BC+0.95A2-2.14B2-2.29C2。

由表3可知，回歸模型與響應(yīng)值之間的關(guān)系具有極顯著性（P＜0.01），失擬項(xiàng)具有不顯著性（P＞0.05）。由表3可以看出，各因素中一次項(xiàng)A、B均極顯著，C顯著，其次是二次項(xiàng)A2顯著，BC、B2、C2極顯著，模型極顯著。說明各因素對EAI的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型對試驗(yàn)的擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小，故可用此方程預(yù)測不同微波作用條件對大豆種皮多糖乳狀液乳化活性的影響。由表2可知，添加大豆種皮多糖的乳狀液EAI值增加，微波功率480 W、微波時(shí)間35 min、料液比1∶20工藝下提取的大豆種皮多糖制備的乳狀液EAI為46.15 m2/g，空白對照大豆分離蛋白乳狀液EAI為16.31 m2/g，說明添加大豆種皮多糖后，乳狀液乳化活性明顯提高。過高微波功率作用使大豆種皮多糖構(gòu)象改變，所獲得的酸性糖組分和中性糖組分含量及分子質(zhì)量發(fā)生變化[21]，造成乳化性的降低，由于微波條件不同，導(dǎo)致大豆種皮多糖中總糖含量發(fā)生變化，具體結(jié)構(gòu)差異有待后續(xù)深入研究。相比于大豆分離蛋白乳狀液，蛋白質(zhì)與多糖非共價(jià)鍵的連接改善了蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)[33]，增加了乳狀液乳化活性。在此研究中，乳狀液中的大豆分離蛋白與大豆種皮多糖之間能夠很好地進(jìn)行交融，大豆種皮多糖溶液帶負(fù)電，大豆種皮多糖的增加略減少了大豆分離蛋白在乳狀液中氮溶解指數(shù)，乳化活性有所下降，乳化穩(wěn)定性顯著提高[34]。在此方面，對于乳狀液中分子間靜電相互作用，在乳狀液分子層界面上，多糖分子在蛋白分子外圍排列緊密形成空間位阻[12]，因此影響了乳狀液EAI。各因素對EAI影響主次順序?yàn)锳（微波功率）＞B（微波時(shí)間）＞C（料液比）。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2值為0.972 5，其矯正決定系數(shù)值為0.937 2，表示該模型的擬合度較好，試驗(yàn)誤差相對較小，其回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

表3 EAI方差分析Table 3 Analysis of variance for EAI

表4 乳狀液Zeta電位絕對值方差分析Table 4 Analysis of variance for Zeta potential absolute value

對Zeta電位絕對值回歸模型Y及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析見表4。Zeta電位絕對值回歸模型為Y=33.34+2.4A+3.09B+1.88C+0.1AB-1.4AC+0.075BC-4.43A2-1.86B2-1.06C2。

由表4可以看出，各因素中一次項(xiàng)A、B均極顯著，C顯著，其次是二次項(xiàng)A2極顯著，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型對試驗(yàn)的擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小，故可用此方程預(yù)測不同微波作用條件對大豆種皮多糖乳狀液Zeta電位的影響。通過對比Zeta電位的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)合原理，根據(jù)課題組前期對大豆種皮多糖的單糖組成及分析[22]，可能原因是大豆種皮多糖的中性側(cè)鏈產(chǎn)生的空間位阻穩(wěn)定乳狀液，多糖連接到蛋白質(zhì)表面，部分結(jié)構(gòu)可以伸入兩相中形成有效的乳狀液保護(hù)層，降低界面張力，增強(qiáng)液滴間靜電排斥或空間位阻[35]，而粒子間的靜電排斥作用只起到次要的輔助穩(wěn)定作用。乳狀液絮凝主要受界面層上發(fā)生的吸引和排斥作用影響，增強(qiáng)液滴間的靜電可提高乳狀液抗絮凝能力，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，添加大豆種皮多糖后乳狀液液滴的Zeta電位絕對值增大，電荷量不斷增加，說明添加大豆種皮多糖后，使蛋白顆粒間的斥力增大，從而提高乳狀液的穩(wěn)定性。得到各因素對Zeta電位絕對值重要性依次排序?yàn)锽（微波時(shí)間）＞A（微波功率）＞C（料液比）。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2值為0.927 0，其校正決定系數(shù)j值為0.829 1。

2.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定

圖1 各因素單獨(dú)作用對指標(biāo)影響的趨勢圖Fig. 1 Effect of individual factors on the response variables

通過圖1可以看出，EAI隨著微波功率的增加，EAI逐漸增大，而隨著提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增大后減小現(xiàn)象，料液比的影響具有同樣規(guī)律。這說明提取出來的大豆種皮多糖的結(jié)構(gòu)隨著微波功率變化而變化[36]，即微波作用條件的不同，導(dǎo)致了提取的大豆種皮多糖自身結(jié)構(gòu)的變化[37-43]，可能是由于多糖表面張力受到破壞，從而再次與蛋白質(zhì)乳狀液結(jié)合后，不能更好地發(fā)揮出乳化活性劑的作用，導(dǎo)致EAI發(fā)生變化。如圖1所示，各個(gè)單因素對Zeta電位的影響中，Zeta電位絕對值隨著微波功率的增大，先增大后減小，隨著微波時(shí)間的延長，曲線上升趨勢由明顯變?yōu)槭婢彛弦罕鹊挠绊懸簿哂型瑯右?guī)律。Zeta電位絕對值的大小關(guān)乎著乳狀液是否絮凝和聚結(jié)，因?yàn)槿闋钜悍€(wěn)定性受界面電荷的影響，Zeta電位絕對值越大，說明顆粒間斥力越大，乳狀液越不容易聚結(jié)，因而也就越穩(wěn)定。微波作用條件的不同，可能導(dǎo)致大豆種皮多糖結(jié)構(gòu)以及表面電荷的影響[44]。在食品乳狀液中，多糖作為一種表面活性劑，對整個(gè)乳狀液的穩(wěn)定性起決定性作用。提取條件不同導(dǎo)致多糖表面電荷不同，從而影響電荷穩(wěn)定，乳狀液液滴的有效電荷與它的實(shí)際電荷不符。當(dāng)帶電荷偏離液滴表面時(shí)，它們的表面會(huì)出現(xiàn)帶電不平衡現(xiàn)象，從而影響乳狀液穩(wěn)定性[45]。

通過圖2可以看出，影響因素AB、AC、BC間存在兩兩作用，其中微波時(shí)間、料液比之間的交互作用明顯，形狀更接近于橢圓形。結(jié)合表3可知，雖然AB、AC交互作用不顯著，但是三者間對EAI的影響存在規(guī)律。與EAI相比，Zeta電位絕對值的兩兩因素交互作用，明顯優(yōu)于EAI，尤其微波功率與微波時(shí)間的交互作用更強(qiáng)，圖形接近橢圓形，并且結(jié)合圖1可知，單因素對Zeta電位絕對值的影響非常顯著，這與表4方差分析結(jié)果相符。

利用Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，并對擬合的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，預(yù)測最佳提取工藝為微波功率567 W、微波時(shí)間42.92 min、料液比1∶20.96（g/mL）。為考察試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可行性，將驗(yàn)證工藝調(diào)整為微波功率640 W、微波時(shí)間43 min、料液比1∶21（g/mL）。此條件下的乳狀液EAI為45.65 m2/g，Zeta電位絕對值為34.16 mV，接近預(yù)測值，但是并不是最佳的試驗(yàn)條件，因此根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取最佳乳化活性、穩(wěn)定性較好的大豆種皮多糖提取工藝為微波功率480 W、微波時(shí)間35 min、料液比1∶20（g/mL）。此結(jié)果可能是由于根據(jù)實(shí)際情況所選取的工藝條件與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)際相差較大，但是通過本次實(shí)驗(yàn)，得到了微波輔助提取工藝對大豆種皮水溶性多糖乳狀液性質(zhì)的影響規(guī)律，驗(yàn)證了外界因素對蛋白與多糖復(fù)合物乳化性能的影響[46]。為后續(xù)深層次剖析其乳化相關(guān)性提供了參考依據(jù)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳乳化活性、乳化穩(wěn)定性的大豆種皮多糖提取工藝為微波功率480 W、微波時(shí)間35 min、料液比1∶20（g/mL），此條件下得到的最優(yōu)多糖-蛋白乳狀液EAI為46.15 m2/g，Zeta電位絕對值為34.3 mV。

2.3 多重光散射對不同提取條件TSI影響規(guī)律

圖3 不同提取條件所制備乳狀液穩(wěn)定性TSI值的影響Fig. 3 Stability TSI values of emulsions containing polysaccharides prepared under different extraction conditions

TSI穩(wěn)定系數(shù)越小、斜率越小，表明乳狀液越穩(wěn)定[47]。如圖3所示，添加大豆種皮多糖的乳狀液TSI曲線斜率均小于大豆分離蛋白空白對照乳狀液，20 min后，TSI整體小于1.3，大豆分離蛋白空白乳狀液TSI大于7。說明在相同時(shí)間內(nèi)，添加大豆種皮多糖的乳狀液穩(wěn)定性較好。從斜率變化趨勢來看，添加大豆種皮多糖的乳狀液TSI變化趨于平穩(wěn)，乳狀液逐漸趨于穩(wěn)定[48]。第15組乳狀液的穩(wěn)定性最好，第14組其次。根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，第13～17組為相同工藝條件下的平行實(shí)驗(yàn)，此工藝條件下乳狀液穩(wěn)定性相對較好。結(jié)合響應(yīng)面分析獲得的最佳工藝參數(shù)，并通過EAI、Zeta電位絕對值的分析，結(jié)果能夠相互印證。

3 結(jié) 論

采用微波提取法提取大豆種皮多糖，通過響應(yīng)面分析可知，3 個(gè)因素對大豆種皮多糖-蛋白乳狀液乳化性影響順序從大到小依次為微波功率＞微波時(shí)間＞料液比。經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)，得出乳狀液穩(wěn)定性最優(yōu)的大豆種皮多糖的提取條件為微波功率480 W、微波時(shí)間35 min、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下乳狀液EAI為46.15 m2/g，Zeta電位絕對值34.3 mV。多重光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了此結(jié)論。本研究內(nèi)容為工業(yè)化生產(chǎn)高乳化穩(wěn)定性大豆種皮多糖提供參考。