江連洲，李佳妮，鄒曉霜，胡 淼，賈子璇，王中江，齊寶坤，李 楊，隋曉楠*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，屬全價(jià)蛋白，富含近20 種氨基酸，是人類生存不可或缺的重要蛋白來源[1]，8 種必需氨基酸含量高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織及世界衛(wèi)生組織推薦比例，不含膽固醇，消化率及功效比近乎等同于動(dòng)物蛋白[2-3]。大豆蛋白主要由β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白構(gòu)成[3]，β-伴球蛋白即7S球蛋白（180～210 kDa），主成分為α、α’及β亞基[4]。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，7S球蛋白中α-亞基為引起機(jī)體過敏的主要致敏原，極易被過敏性皮炎病患的血清IgE抗體識(shí)別[5]。大豆球蛋白即11S球蛋白（340～375 kDa），主要由酸性及堿性亞基通過二硫鍵連接而成。其中，由于大豆分離蛋白（soybean protein isolates，SPI）具有蛋白含量高、功能特性突出等優(yōu)點(diǎn)而成為食品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多的一種大豆蛋白。SPI為氨基酸間相聯(lián)結(jié)形成的具特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，分子構(gòu)造較緊密，對(duì)酶解作用也有較強(qiáng)抗力[6]。

花青素為植物次生代謝產(chǎn)物，屬類黃酮化合物，其基本結(jié)構(gòu)為3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃，大多數(shù)花青素在花色基元的3,5,7-碳位上有取代羥基[7]?；ㄇ嗨鼐哂信c蛋白質(zhì)選擇性結(jié)合的能力，包括氫鍵作用、疏水作用及靜電吸附等。氫鍵的形成主要是通過花青素結(jié)構(gòu)中的氫原子與蛋白質(zhì)中的電負(fù)性離子結(jié)合；同時(shí)花青素中含疏水性基團(tuán)，蛋白中存在疏水性氨基酸，因而兩者也可通過疏水作用結(jié)合，花青素對(duì)蛋白的結(jié)合作用能夠在一定程度改變蛋白結(jié)構(gòu)功能及消化性等[8-9]?；ㄇ嗨卦谏韺W(xué)中扮演重要角色，有助于預(yù)防多種疾?。喊ò┌Y[10-11]、心臟病、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病[12]等，同時(shí)具有抗炎與增強(qiáng)免疫力等高效生物活性[13]。

日常飲食中，大豆蛋白會(huì)同某些食物組分發(fā)生相互作用，從而影響蛋白的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、功能及消化特性等。經(jīng)研究積累，現(xiàn)已對(duì)部分食用蛋白的酶降解情況、生物利用率有了較充分的認(rèn)知，但對(duì)其在機(jī)體消化道環(huán)境中的消化情況卻知之甚少，對(duì)蛋白在多食物組分體系影響下的消化特性研究更為匱乏。蛋白質(zhì)對(duì)機(jī)體生命活動(dòng)意義重大，其被消化吸收的程度，是衡量其營養(yǎng)價(jià)值的重要前提，因此從營養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)學(xué)角度而言，明晰蛋白同其他食物組分互作對(duì)蛋白消化特性的影響具有重要意義[14]。

本實(shí)驗(yàn)將SPI與花青素以不同質(zhì)量配比，采用體外消化模型模擬蛋白體外消化過程，通過研究各樣品中蛋白水解率、結(jié)構(gòu)、亞基組成及分子質(zhì)量分布差異，闡明花青素添加量對(duì)蛋白消化特性及體外消化結(jié)構(gòu)的影響。本實(shí)驗(yàn)通過深入探究機(jī)體在多食物組分下對(duì)蛋白消化、吸收的程度，全面深入評(píng)價(jià)及建立大豆蛋白營養(yǎng)消化模式，旨在為食品生產(chǎn)加工領(lǐng)域制備易消化、高吸收、低致敏的優(yōu)質(zhì)蛋白產(chǎn)品及營養(yǎng)膳食搭配方式提供理論指導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)大豆蛋白產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 250 U/mg） 美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 中國Solarbio公司；甲酸、乙腈（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、六水氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS超速高速冷凍離心機(jī) 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；固相萃取裝置 上海興納生物科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海恬恒儀器有限公司；WAT023635高效液相色譜儀、C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，Sunfire）美國Waters公司；排阻色譜柱（300 mm×4.6 mm，Wilmington） 美國安捷倫科技有限公司；恒溫水浴振蕩搖床 常州恩培儀器制造有限公司；GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司；F-4500型熒光光譜儀 日本Hitachi公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Petruccelli等[15]的方法。大豆去皮粉碎，過60 目篩網(wǎng)后與正己烷1∶3（g/mL）比例混合脫脂，重復(fù)3 次，即得脫脂豆粉。將脫脂豆粉與水以1∶20（g/mL）比例混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0，室溫下充分?jǐn)嚢? h。攪拌后懸濁液于4 ℃、14 000×g離心20 min取上清液。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH 4.5，靜置溶液2 h后以6 000×g離心20 min，取離心后沉淀用蒸餾水充分水洗3 次后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，樣品-40 ℃預(yù)凍24 h后冷凍干燥，研磨即得SPI。

1.3.2 固相萃取提純花青素

固相萃取提純黑米提取物中花青素步驟參照Rodriguez-Saona等[16]的方法。將黑米提取物溶于去離子水后，減壓抽濾。隨后將濾液通過固相萃取柱使花青素被完全吸附，用5 倍柱體積0.01% HCl溶液洗脫樣品中不溶性成分，如糖、酸等，隨后用3 倍柱體積的乙酸乙酯溶液洗脫樣品中除花青素外的多酚類雜質(zhì)，如酚酸、黃酮等，最后用4 倍柱體積甲醇溶液洗脫吸附于柱上的花青素。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇得到花青素提純樣品，溶于酸性水溶液中冷凍保存，采用高效液相色譜法確定純化后花青素質(zhì)量濃度及純度。

1.3.3 花青素定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確量取矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)品，將其溶解至1%鹽酸甲醇溶液內(nèi)，并經(jīng)不同比例稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.000 1、0.001、0.025、0.05、0.1 mg/mL的標(biāo)液，將各質(zhì)量濃度標(biāo)液過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜進(jìn)樣分析，以各標(biāo)液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1.32×10-8x-5.414×10-4，R2=0.997 8。線性回歸分析表明，質(zhì)量濃度與峰面積在0.000 1～0.1 mg/mL內(nèi)有良好線性關(guān)系[17]。

1.3.4 高效液相色譜法定量花青素質(zhì)量濃度

取純化的花青素提取物過0.45 μm濾膜，利用C18色譜柱及高效液相色譜設(shè)備進(jìn)行分析。流速1 mL/min，柱箱溫度25 ℃，流動(dòng)相A為5%甲酸，流動(dòng)相B為100%乙腈。梯度洗脫：0～5 min 100% A； 20 min 90% A；40 min 87% A；44 min 80% A；50 min 75% A；55 min 0% A。進(jìn)樣量50 μL，檢測器波長520 nm[18]。

1.3.5 SPI-花青素復(fù)合體系制備

依照Nagy等[19]研究方法稍作修改。將SPI充分溶解至0.01 mol/L磷酸緩沖液中（pH 7.4）配制成50 mg/mL SPI溶液，并將花青素按一定比例溶解于SPI溶液中，使花青素最終質(zhì)量濃度分別為0.5、1 mg/mL和2.5 mg/mL。按一定質(zhì)量比溶解于SPI溶液并于室溫下混合攪拌2 h制成SPI-花青素復(fù)合體系。

1.3.6 體外模擬消化

體外模擬消化參考Minekus等[20]方法并稍作修改。將50 mL待消化樣品混于37.5 mL模擬胃環(huán)境的電解質(zhì)溶液中（含6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2(H2O)6、0.5 mmol/L (NH4)2CO3），并于電解液中加入25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，精密量取一定體積1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)混合液pH 2.3，并記錄鹽酸用量V（HCl），隨后加入（4.475-V（HCl））mL蒸餾水，最后加入8 mL胃蛋白酶（25 000 U/mL），使最終消化液中蛋白酶達(dá)2 000 U/mL，上述樣品及試劑在混合前均需在37 ℃條件下預(yù)熱30 min。將配制好的混合液置于37 ℃水浴振蕩搖床中進(jìn)行胃部消化反應(yīng)1.5 h，并實(shí)時(shí)監(jiān)控pH值恒定。體外消化過程中，分別于第0、5、15、30、45、60、90分鐘處進(jìn)行抽樣檢測以探究消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征及蛋白解離機(jī)制，各消化終點(diǎn)處采用0.5 mol/L NaHCO3將消化液pH 7.0終止反應(yīng)。消化液高速離心去除不溶性蛋白沉淀，取上清液，冷凍干燥，備用。

1.3.7 蛋白水解度測定

采用TCA沉淀法測定蛋白水解度。TCA屬于典型蛋白沉淀劑之一，能夠使大分子蛋白及較大肽段沉淀。隨消化進(jìn)行，蛋白的肽鏈被蛋白酶水解成大小不等的片段，此時(shí)在TCA中溶解指數(shù)增大。針對(duì)特定反應(yīng)底物而言，TCA能夠定性反映出蛋白水解程度，其溶解指數(shù)越大，代表被水解生成的短肽鏈越多。本實(shí)驗(yàn)以TCA可溶解性氮含量表征蛋白水解度，在各消化取樣點(diǎn)處取消化液適量，隨后立即與等體積10% TCA溶液混合以沉淀未消化的大分子質(zhì)量蛋白?；旌弦红o置10 min后于8 000×g離心15 min。采用微量凱氏定氮（N×6.25）測定沉淀及其他蛋白樣品對(duì)應(yīng)的氮含量。蛋白質(zhì)水解度計(jì)算公式如下[21]：

式中：DH為水解度/%；N0為消化前蛋白樣品中TCA-沉淀氮含量/mg；Nt為消化t min后TCA-沉淀氮含量/mg；Ntot為蛋白樣品中總氮含量/mg。

1.3.8 蛋白質(zhì)亞基組成的測定

參考Laemmli等[22]的方法并稍加修改。將20 μL樣品稀釋后置于含β-巰基乙醇的2×上樣緩沖液中，并于95 ℃加熱90 s做變性處理。分別配制15%分離膠與5%濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳過程電壓恒定，濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓120 V。染色劑為0.25 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250（0.25 g考馬斯亮藍(lán)R-250，400 mL甲醇、70 mL冰乙酸定容至1 L），電極液為14.41 g甘氨酸、3.03 g Tris、1.0 g SDS定容至1 L，脫色液A為甲醇-冰乙酸-水（40∶7∶53，V/V），脫色液B為甲醇-冰乙酸-水（5∶7∶88，V/V）。電泳膠片采用GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.3.9 體外模擬消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布分析

利用體積排阻色譜-高效液相色譜法測定水解蛋白肽的分子質(zhì)量分布。將經(jīng)胃蛋白酶水解的蛋白離心分離取上清液，稀釋后過0.45 μm濾膜。排阻色譜柱（300 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：150 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；樣品進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相流速0.3 mL/min，紫外檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，運(yùn)行樣品30 min。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：牛血清白蛋白（67 000 Da）、雞白蛋白（44 000 Da）、核糖核酸酶（13 700 Da）、胰島素（5 500 Da）、VB12（1 350 Da）。

1.3.10 蛋白空間構(gòu)象測定

1.3.10.1 圓二色譜分析

以圓二色譜法測定樣品中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，將樣品溶于0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）中稀釋，使蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。25 ℃、以100 nm/min掃描速率在190～260 nm范圍內(nèi)掃描，樣品池光程1 mm，分辨率0.1 nm。采用“CDPro”曲線擬合軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析求得二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，每組樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.10.2 熒光光譜分析

參考江連洲等[23]方法并稍作修改。待測樣品用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，使樣品蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg/mL[24]。熒光發(fā)射光譜分析時(shí)采用蛋白分子內(nèi)色氨酸熒光基團(tuán)作探針，激發(fā)波長290 nm，測定波長范圍為300～450 nm，掃描速率240 nm/s，激發(fā)條帶寬度10 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均10 nm，每組樣品重復(fù)測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 ±s，使用Statistics 8進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析（P＜0.05為顯著性差異）。采用Origin 8.5等軟件對(duì)數(shù)據(jù)、圖表進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化花青素質(zhì)量濃度確定

圖1 純化花青素色譜圖Fig. 1 Chromatogram of purified anthocyanin

如圖1所示，黑米提取物中花青素主成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，為方便計(jì)算，將矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度視為花青素質(zhì)量濃度做近似處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終花青素純度為（91.23±0.02）%，可認(rèn)為純品，相對(duì)分子質(zhì)量按449.38計(jì)算。矢車菊素-3-葡萄糖苷峰[25]的保留時(shí)間為25.799 min，將該峰面積3 128 521代入標(biāo)曲求得純化后花青素質(zhì)量濃度約為50 mg/mL。

2.2 SPI體外消化水解度

圖2 添加不同質(zhì)量花青素后SPI體外消化水解度Fig. 2 Change in TCA solbule nitrogen content during in vitro digestion of SPI with different concentrations of anthocyanin added

模擬胃液消化過程中，蛋白多肽被逐漸水解，蛋白水解程度顯著，說明蛋白對(duì)胃蛋白酶較敏感。由圖2可知，隨消化時(shí)間延長，蛋白水解度逐漸增加，且在最初消化的30 min內(nèi)水解度增加尤為顯著，消化60 min后水解趨于穩(wěn)定，這是樣品底物質(zhì)量濃度及酶活隨反應(yīng)進(jìn)行而降低，復(fù)合物經(jīng)初始階段積累達(dá)到穩(wěn)態(tài)，并趨于恒定等原因造成的[26]。研究表明，隨樣品中花青素質(zhì)量增加，蛋白質(zhì)消化率呈下降趨勢，且花青素質(zhì)量配比越大，蛋白水解受到的影響越大。空白組蛋白在經(jīng)90 min消化后，水解度高達(dá)48.5%；SPI與花青素質(zhì)量比為1∶0.01時(shí)蛋白最終水解度為45.8%，水解度降低不明顯；質(zhì)量比為1∶0.02時(shí)水解度為42%，但增加至1∶0.05的質(zhì)量比時(shí)蛋白的水解度顯著降低，僅有36.5%。這表明花青素的添加對(duì)蛋白消化具有一定不利影響，推測是由于SPI與花青素發(fā)生結(jié)合并使自身空間結(jié)構(gòu)發(fā)生部分程度變化導(dǎo)致的。同時(shí)，花青素等多酚類物質(zhì)還具有一定程度沉淀蛋白質(zhì)的特性[27]，由于SPI主要由球蛋白組成，這種蛋白質(zhì)分子極性基團(tuán)朝向外部，可以與極性水分子相互作用，添加花青素后，可能由于SPI的側(cè)鏈氨基酸極性基團(tuán)與花青素的酚羥基結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子體系極性下降，溶解度降低。而蛋白質(zhì)的溶解性又與其功能、加工及消化特性等息息相關(guān)，因此花青素對(duì)蛋白的沉淀性也是對(duì)蛋白水解度產(chǎn)生影響的因素之一。酚類化合物絡(luò)合對(duì)蛋白水解度的影響與酚類化合物及蛋白種類和性質(zhì)等多因素有關(guān)，兩者互作對(duì)各自的影響也是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程。

2.3 SPI及其消化產(chǎn)物亞基組成分析

圖3 SPI及SPI-花青素復(fù)合物中蛋白體外消化SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE analysis of in vitro pepsin digests of SPI and SPI-anthocyanins complexs

如圖3所示，添加不同質(zhì)量花青素的蛋白樣品中各組分受胃蛋白酶的降解情況有顯著差別。4 組樣品中的β-伴大豆球蛋白相較于大豆球蛋白更易于被胃蛋白酶酶解，且大豆球蛋白在經(jīng)過連續(xù)90 min的消化后也僅有部分被酶解。除圖3a樣品外，其余樣品經(jīng)胃蛋白酶酶解60 min后，α’-亞基及α-亞基的電泳條帶對(duì)應(yīng)組分完全被消化降解，圖3a樣品在經(jīng)過連續(xù)消化90 min后該處組分仍有部分未能被降解。針對(duì)大豆球蛋白而言，相對(duì)不易被消化，降解程度也較小，其A1～A4亞基及B亞基僅在圖3a樣品中有稍明顯水解，從而降解為相對(duì)分子質(zhì)量小于17 kDa的蛋白肽。而對(duì)另外3 組樣品而言，大豆球蛋白的消化皆不明顯。

SDS-PAGE顯示，添加不同質(zhì)量花青素的樣品中蛋白消化程度具有較顯著區(qū)別。對(duì)照組圖3a中蛋白消化水解相對(duì)徹底，隨著花青素添加量的增多，蛋白質(zhì)整體消化程度逐漸降低，具體表現(xiàn)為花青素的添加促進(jìn)了以α-亞基條帶組分為代表的β-伴大豆球蛋白亞基的消化，但卻顯著抑制了大豆球蛋白中各亞基組分消化，且尤以圖3d中花青素添加量為最大時(shí)對(duì)蛋白消化影響最為顯著，這與圖2中蛋白質(zhì)水解度的測定結(jié)果相吻合。胃蛋白酶對(duì)不同蛋白組分的消化情形與其空間結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，花青素的添加部分程度改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，最終使其添加對(duì)蛋白的水解消化產(chǎn)生了一定不利影響。

然而，即使花青素的添加部分程度的降低了蛋白水解度，但由圖3可看出，花青素以上述任何比例添加進(jìn)蛋白樣品時(shí)，都能夠有效促進(jìn)7S球蛋白中α-亞基的水解，而據(jù)相關(guān)研究表明，α-亞基為大豆蛋白致使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主致敏原之一[28]，且經(jīng)蛋白酶體外酶解可以部分去除該亞基組分[29]，因而推測花青素對(duì)7S球蛋白消化的促進(jìn)作用能夠降低大豆蛋白致敏性，該結(jié)論對(duì)大豆蛋白相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)加工具有一定的積極作用。

2.4 SPI及其消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布分析

因體積排阻色譜柱的填料凝膠含大量微孔，所以樣品在經(jīng)過體積排阻色譜柱時(shí)，僅其中分子質(zhì)量較小的組分及緩沖溶液得以通過，進(jìn)而使較大分子質(zhì)量組分被阻擋于外部，因此樣品在填料間隙內(nèi)流動(dòng)時(shí)較大分子質(zhì)量組分首先被洗脫，小分子質(zhì)量組分隨后被洗脫[30]。

根據(jù)最小二乘法計(jì)算出該蛋白標(biāo)曲回歸方程：y=-2.002 6x+17.620，其中x為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)，y為洗脫時(shí)間。利用該式即可根據(jù)蛋白樣品的分子質(zhì)量估算出對(duì)應(yīng)組分的洗脫時(shí)間。各蛋白樣品及消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布如表1所示。

表1 未添加花青素的SPI消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mas distribution of SPI hydrolysates

SPI主要是由7S和11S兩種球蛋白組成，7S的分子質(zhì)量范圍在150～200 kDa，由3 個(gè)亞基組成，亞基的分子質(zhì)量范圍在42～83 kDa之間；11S的分子質(zhì)量范圍在300～380 kDa之間，由6 個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基由一個(gè)酸性多肽和一個(gè)堿性多肽組成，多肽的分子質(zhì)量范圍在10～35 kDa之間。蛋白體外模擬消化進(jìn)程中，分子質(zhì)量變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，蛋白由際水解為胨，最后被徹底水解為小分子肽。由表1可知，未水解的大豆蛋白分子質(zhì)量主要集中在10 kDa以上，特別以分子質(zhì)量高于100 kDa蛋白居多，比例高達(dá)83.12%。而此時(shí)，分子質(zhì)量在3～10 kDa之間的小肽含量微乎其微。隨消化進(jìn)行，分子質(zhì)量100 kDa以上蛋白比例逐漸減小，在消化至15～30 min時(shí)其含量大幅度降低，并于消化終點(diǎn)時(shí)比例降至29.93%。同時(shí)，分子質(zhì)量分布為10～100 kDa的蛋白肽含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，這可能由于在消化初期，分子質(zhì)量100 kDa以上蛋白逐漸被消化，致使分布為10～100 kDa的蛋白肽含量有所增加，隨著消化反應(yīng)進(jìn)行，分布在10～100 kDa的蛋白肽也進(jìn)一步被水解成更小的肽片段，而大于100 kDa以上蛋白隨后水解的更為徹底造成的，這也使得3～10 kDa及小于3 kDa的蛋白肽含量有較為明顯的上升。最終，蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要集中在3～100 kDa之間，這與SDS的分析結(jié)果一致。

表2 SPI-花青素（1∶0.01）消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.01) complex

表3 SPI-花青素（1∶0.02）消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.02) complex

表4 SPI-花青素（1∶0.05）消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.05) complex

通過對(duì)表2～4與表1比較發(fā)現(xiàn)，在未消化的4 種樣品中，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要都集中在100 kDa以上，且所占比例相似。隨消化時(shí)間延長，大于100 kDa的蛋白逐漸被消化，且消化均在30 min內(nèi)較明顯，但添加的花青素量越大，各消化時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的消化產(chǎn)物中該分子質(zhì)量蛋白所占比例的降低越不顯著，這主要是由于花青素的添加，降低了蛋白水解程度。消化初期，各樣品中低于10 kDa分子質(zhì)量的蛋白肽含量均很少，隨著反應(yīng)進(jìn)行，大分子質(zhì)量蛋白逐級(jí)水解，消化終點(diǎn)處，空白組中10 kDa以下蛋白肽含量增加至35%，添加花青素的蛋白樣品中其含量也有所增加，但消化最不明顯的樣品組其含量只增加至20%，同時(shí)各樣品中蛋白肽分子質(zhì)量多集中在3～10 kDa之間。10～100 kDa分子質(zhì)量肽段均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，主要由于消化初期，高于100 kDa的蛋白初步水解成10～100 kDa分子質(zhì)量肽段，而后期則是因100 kDa以上的蛋白及10～100 kDa分子質(zhì)量多肽進(jìn)一步水解使其含量降低，也因此使得更小分子的肽含量有所增加，但花青素添加量的增多，導(dǎo)致最終水解產(chǎn)生的小分子肽含量降低，這也是由于底物受花青素影響水解不夠徹底造成的，這與SDS的分析結(jié)果也是相吻合的。

2.5 大豆蛋白及消化產(chǎn)物空間構(gòu)象分析

2.5.1 SPI及消化產(chǎn)物圓二色譜分析

圖4 未消化大豆蛋白（a）和體外模擬消化后大豆蛋白（b）樣品的圓二色譜圖Fig. 4 CD spectra of SPI (a), SPI-anthocyanin complexes and hydrolysates (b)

表5 圓二色譜測定天然及SPI-花青素復(fù)合物中大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 5 Secondary structure contents in SPI and SPI-anthocyanin complexes%

表6 圓二色譜測定不同質(zhì)量比花青素復(fù)合的SPI消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 6 Secondary structure contents in digests of SPI and SPI-anthocyanin complexes%

圓二色譜是一種高效而精確定性定量分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用手段，能夠在液體蛋白樣品中進(jìn)行直接測定[31]。本實(shí)驗(yàn)選擇能夠反映肽鍵圓二色性的遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～260 nm）光譜條件，對(duì)天然及與花青素復(fù)合后的SPI經(jīng)1.5 h體外模擬消化前后的蛋白樣品進(jìn)行圓二色譜分析。圖4a為天然及與花青素復(fù)合后的蛋白圓二色譜圖，圖4b所示為體外模擬消化后大豆蛋白圓二色譜圖，SPI與花青素復(fù)合后二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化見表5，對(duì)應(yīng)消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化見表6。在205 nm和217 nm波長處的摩爾橢圓度有兩個(gè)最小值，在190～195 nm附近有一最大正值，該值為蛋白質(zhì)α-螺旋的典型特征峰。圖4a顯示隨著花青素添加量的增多，α-螺旋的典型特征峰逐漸降低，表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。圖4b中在190～195 nm左右處的橢圓率顯著降低，表明在消化過程中α-螺旋結(jié)構(gòu)有較明顯損失。同時(shí)，當(dāng)?shù)鞍姿鈺r(shí)，217 nm波長處的橢圓率負(fù)值有所減少，這也表明蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞[32]。由表6可知，SPI與花青素復(fù)合后，α-螺旋含量降低，β-折疊含量遞增，β-轉(zhuǎn)角含量高低浮動(dòng)整體無明顯變化，無規(guī)則卷曲含量升高，這些現(xiàn)象可能是由于花青素結(jié)合到了SPI α-螺旋中的某些氨基酸區(qū)域，進(jìn)而蛋白分子部分展開，空間構(gòu)象被改變所致，且該現(xiàn)象在花青素質(zhì)量配比增大后更顯著。謝鳳英等[33]研究表明，多酚化合物的添加會(huì)使米糠蛋白的α-螺旋含量降低，β-折疊結(jié)構(gòu)含量先升高后降低，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量增加，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，也有相關(guān)研究表明，綠原酸、阿魏酸與香豆酸（香豆酸）等酚類物質(zhì)同α-乳白蛋白及β-乳球蛋白互作，能夠降低α-螺旋含量，增加β-折疊和轉(zhuǎn)角含量。天然及添加花青素的蛋白樣品消化后，α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)含量均降低，且花青素質(zhì)量配比越大，消化后α-螺旋及β-折疊含量降低值越小，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化越不明顯，推測是因各花青素與蛋白復(fù)合，可能在某種程度上影響蛋白酶解程度，使各酶解產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)未消化樣品間的空間構(gòu)象存在不同程度的差異。消化30 min時(shí)，α-螺旋及β-折疊含量降低較明顯（表中未給出），表明兩者的消化水解主要發(fā)生于反應(yīng)初期，并推斷α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的消化可能增加了無規(guī)卷曲的含量，各結(jié)構(gòu)間可能存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。

2.5.2 SPI及消化產(chǎn)物熒光光譜分析

圖5 同一蛋白樣品不同消化時(shí)間熒光譜圖Fig. 5 Fluorescence emission spectra of digested SPI samples at different periods

圖6 不同蛋白樣品同一消化時(shí)間熒光譜圖Fig. 6 Fluorescence emission spectra of digested SPI-anthocyanin complexes at each period

蛋白質(zhì)分子可解離的基團(tuán)除氨基和羧基外，還有大量凸出的側(cè)鏈基團(tuán)，如組氨酸的咪唑，酪氨酸的羥基等。消化過程中蛋白質(zhì)主側(cè)結(jié)構(gòu)解離與重聚的變化能夠使蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的電離情況發(fā)生變化，從而使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此通過研究不同消化程度的消化產(chǎn)物中蛋白熒光性質(zhì)變化，可以得出不同消化程度條件下大豆蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)改變的信息。290 nm波長處激發(fā)產(chǎn)生的熒光光譜主要是由蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基發(fā)射的，色氨酸殘基是蛋白質(zhì)的主要內(nèi)源熒光源，通過記錄色氨酸的熒光圖譜，以反映色氨酸殘基所處微環(huán)境變化情況，從而揭示出在不同體外模擬消化時(shí)間內(nèi)花青素質(zhì)量濃度對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

如圖5所示，各樣品的SPI在連續(xù)1.5 h的消化過程中，λmax均分布在346.6～350.6 nm內(nèi)，且隨消化時(shí)間延長，消化產(chǎn)物的λmax整體呈紅移趨勢，表明蛋白在消化過程中逐漸解離，蛋白分子內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)暴露在外部極性環(huán)境中；也有部分暴露于分子外部極性環(huán)境的色氨酸殘基轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部非極性環(huán)境中，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。由圖6可知，未消化樣品中，隨花青素添加量增大，大豆蛋白最大熒光發(fā)射波長λmax發(fā)生紅移，由346.2 nm偏移至350.2 nm，說明花青素與大豆蛋白發(fā)生了結(jié)合，從而改變了蛋白構(gòu)象，色氨酸微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展。任一相同消化點(diǎn)時(shí)，隨花青素質(zhì)量配比的增加，消化產(chǎn)物的λmax均逐漸發(fā)生紅移，這與花青素質(zhì)量配比增加，樣品中—OH基團(tuán)增多有關(guān)，同時(shí)，也是由于更多的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的舒展導(dǎo)致[34]。

此外，花青素質(zhì)量配比的增加會(huì)導(dǎo)致蛋白樣品在任一相同消化時(shí)間點(diǎn)的蛋白熒光強(qiáng)度降低，特別是SPI與花色素質(zhì)量比為1∶0.05時(shí)，這也說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，花青素與色氨酸殘基間發(fā)生了互作而削弱了SPI的熒光強(qiáng)度[34]。

3 結(jié) 論

體外模擬消化實(shí)驗(yàn)表明，隨消化時(shí)間延長，大豆蛋白消化程度逐漸增加，且水解主要發(fā)生在消化前30 min?；ㄇ嗨氐奶砑訒?huì)降低蛋白質(zhì)水解度，且花青素質(zhì)量配比越大，抑制消化效果越明顯。

采用SDS-PAGE對(duì)各蛋白樣品及消化產(chǎn)物進(jìn)行亞基組成分析，表明胃蛋白酶對(duì)蛋白各組分消化性能有較顯著差異，7S較11S球蛋白更易被消化，花青素的添加抑制11S蛋白水解，卻能夠有效促進(jìn)大豆蛋白主要致敏原α-亞基降解，推測花青素的添加可有效降低大豆蛋白食用致敏性。

利用排阻色譜分析蛋白樣品及消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布，結(jié)果表明，隨消化反應(yīng)的進(jìn)行，大分子質(zhì)量蛋白逐漸被水解成小分子肽，最終分子質(zhì)量分布集中在3～100 kDa之間，同時(shí)花青素的添加使得最終消化產(chǎn)物分布在3 kDa以下的蛋白肽含量減少，這與SDS-PAGE分析結(jié)果一致。

圓二色譜分析結(jié)果表明，花青素改變了SPI構(gòu)象，主要表現(xiàn)在α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角變化無明顯規(guī)律，無規(guī)則卷曲含量增加，構(gòu)象的變化對(duì)蛋白的消化過程及水解度產(chǎn)生一定程度影響，從而造成消化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)也被不同程度的改變。

熒光分析表明，蛋白及消化產(chǎn)物中，色氨酸殘基分布于蛋白分子外極性環(huán)境中，且隨花青素質(zhì)量配比增加，消化產(chǎn)物的λmax逐漸紅移。大豆蛋白在消化過程中逐漸被解離，熒光基團(tuán)暴露于溶劑中，但花青素的添加對(duì)蛋白有顯著熒光猝滅效果。