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        花青素對大豆蛋白體外胃消化結(jié)構(gòu)的影響

        2018-10-31 00:51:38江連洲李佳妮鄒曉霜賈子璇王中江齊寶坤隋曉楠
        食品科學(xué) 2018年20期
        關(guān)鍵詞:亞基花青素水解

        江連洲,李佳妮,鄒曉霜,胡 淼,賈子璇,王中江,齊寶坤,李 楊,隋曉楠*

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白,屬全價蛋白,富含近20 種氨基酸,是人類生存不可或缺的重要蛋白來源[1],8 種必需氨基酸含量高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織及世界衛(wèi)生組織推薦比例,不含膽固醇,消化率及功效比近乎等同于動物蛋白[2-3]。大豆蛋白主要由β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白構(gòu)成[3],β-伴球蛋白即7S球蛋白(180~210 kDa),主成分為α、α’及β亞基[4]。免疫印跡實驗表明,7S球蛋白中α-亞基為引起機(jī)體過敏的主要致敏原,極易被過敏性皮炎病患的血清IgE抗體識別[5]。大豆球蛋白即11S球蛋白(340~375 kDa),主要由酸性及堿性亞基通過二硫鍵連接而成。其中,由于大豆分離蛋白(soybean protein isolates,SPI)具有蛋白含量高、功能特性突出等優(yōu)點而成為食品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多的一種大豆蛋白。SPI為氨基酸間相聯(lián)結(jié)形成的具特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子,分子構(gòu)造較緊密,對酶解作用也有較強(qiáng)抗力[6]。

        花青素為植物次生代謝產(chǎn)物,屬類黃酮化合物,其基本結(jié)構(gòu)為3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃,大多數(shù)花青素在花色基元的3,5,7-碳位上有取代羥基[7]?;ㄇ嗨鼐哂信c蛋白質(zhì)選擇性結(jié)合的能力,包括氫鍵作用、疏水作用及靜電吸附等。氫鍵的形成主要是通過花青素結(jié)構(gòu)中的氫原子與蛋白質(zhì)中的電負(fù)性離子結(jié)合;同時花青素中含疏水性基團(tuán),蛋白中存在疏水性氨基酸,因而兩者也可通過疏水作用結(jié)合,花青素對蛋白的結(jié)合作用能夠在一定程度改變蛋白結(jié)構(gòu)功能及消化性等[8-9]?;ㄇ嗨卦谏韺W(xué)中扮演重要角色,有助于預(yù)防多種疾?。喊ò┌Y[10-11]、心臟病、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病[12]等,同時具有抗炎與增強(qiáng)免疫力等高效生物活性[13]。

        日常飲食中,大豆蛋白會同某些食物組分發(fā)生相互作用,從而影響蛋白的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、功能及消化特性等。經(jīng)研究積累,現(xiàn)已對部分食用蛋白的酶降解情況、生物利用率有了較充分的認(rèn)知,但對其在機(jī)體消化道環(huán)境中的消化情況卻知之甚少,對蛋白在多食物組分體系影響下的消化特性研究更為匱乏。蛋白質(zhì)對機(jī)體生命活動意義重大,其被消化吸收的程度,是衡量其營養(yǎng)價值的重要前提,因此從營養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)學(xué)角度而言,明晰蛋白同其他食物組分互作對蛋白消化特性的影響具有重要意義[14]。

        本實驗將SPI與花青素以不同質(zhì)量配比,采用體外消化模型模擬蛋白體外消化過程,通過研究各樣品中蛋白水解率、結(jié)構(gòu)、亞基組成及分子質(zhì)量分布差異,闡明花青素添加量對蛋白消化特性及體外消化結(jié)構(gòu)的影響。本實驗通過深入探究機(jī)體在多食物組分下對蛋白消化、吸收的程度,全面深入評價及建立大豆蛋白營養(yǎng)消化模式,旨在為食品生產(chǎn)加工領(lǐng)域制備易消化、高吸收、低致敏的優(yōu)質(zhì)蛋白產(chǎn)品及營養(yǎng)膳食搭配方式提供理論指導(dǎo),進(jìn)而促進(jìn)大豆蛋白產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        大豆 市售;黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司;胃蛋白酶(3 250 U/mg) 美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)試劑盒 中國Solarbio公司;甲酸、乙腈(均為色譜純) 美國Sigma-Aldrich公司;正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、六水氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA) 科密歐化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        GL-25MS超速高速冷凍離心機(jī) 上海盛析儀器設(shè)備有限公司;FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司;固相萃取裝置 上海興納生物科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海恬恒儀器有限公司;WAT023635高效液相色譜儀、C18反向色譜柱(250 mm×4.6 mm,Sunfire)美國Waters公司;排阻色譜柱(300 mm×4.6 mm,Wilmington) 美國安捷倫科技有限公司;恒溫水浴振蕩搖床 常州恩培儀器制造有限公司;GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司;J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司;F-4500型熒光光譜儀 日本Hitachi公司;PHS-25型酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 SPI制備

        參照Petruccelli等[15]的方法。大豆去皮粉碎,過60 目篩網(wǎng)后與正己烷1∶3(g/mL)比例混合脫脂,重復(fù)3 次,即得脫脂豆粉。將脫脂豆粉與水以1∶20(g/mL)比例混合,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0,室溫下充分?jǐn)嚢? h。攪拌后懸濁液于4 ℃、14 000×g離心20 min取上清液。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH 4.5,靜置溶液2 h后以6 000×g離心20 min,取離心后沉淀用蒸餾水充分水洗3 次后,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0,樣品-40 ℃預(yù)凍24 h后冷凍干燥,研磨即得SPI。

        1.3.2 固相萃取提純花青素

        固相萃取提純黑米提取物中花青素步驟參照Rodriguez-Saona等[16]的方法。將黑米提取物溶于去離子水后,減壓抽濾。隨后將濾液通過固相萃取柱使花青素被完全吸附,用5 倍柱體積0.01% HCl溶液洗脫樣品中不溶性成分,如糖、酸等,隨后用3 倍柱體積的乙酸乙酯溶液洗脫樣品中除花青素外的多酚類雜質(zhì),如酚酸、黃酮等,最后用4 倍柱體積甲醇溶液洗脫吸附于柱上的花青素。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇得到花青素提純樣品,溶于酸性水溶液中冷凍保存,采用高效液相色譜法確定純化后花青素質(zhì)量濃度及純度。

        1.3.3 花青素定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        準(zhǔn)確量取矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)品,將其溶解至1%鹽酸甲醇溶液內(nèi),并經(jīng)不同比例稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.000 1、0.001、0.025、0.05、0.1 mg/mL的標(biāo)液,將各質(zhì)量濃度標(biāo)液過0.45 μm濾膜,采用高效液相色譜進(jìn)樣分析,以各標(biāo)液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=1.32×10-8x-5.414×10-4,R2=0.997 8。線性回歸分析表明,質(zhì)量濃度與峰面積在0.000 1~0.1 mg/mL內(nèi)有良好線性關(guān)系[17]。

        1.3.4 高效液相色譜法定量花青素質(zhì)量濃度

        取純化的花青素提取物過0.45 μm濾膜,利用C18色譜柱及高效液相色譜設(shè)備進(jìn)行分析。流速1 mL/min,柱箱溫度25 ℃,流動相A為5%甲酸,流動相B為100%乙腈。梯度洗脫:0~5 min 100% A; 20 min 90% A;40 min 87% A;44 min 80% A;50 min 75% A;55 min 0% A。進(jìn)樣量50 μL,檢測器波長520 nm[18]。

        1.3.5 SPI-花青素復(fù)合體系制備

        依照Nagy等[19]研究方法稍作修改。將SPI充分溶解至0.01 mol/L磷酸緩沖液中(pH 7.4)配制成50 mg/mL SPI溶液,并將花青素按一定比例溶解于SPI溶液中,使花青素最終質(zhì)量濃度分別為0.5、1 mg/mL和2.5 mg/mL。按一定質(zhì)量比溶解于SPI溶液并于室溫下混合攪拌2 h制成SPI-花青素復(fù)合體系。

        1.3.6 體外模擬消化

        體外模擬消化參考Minekus等[20]方法并稍作修改。將50 mL待消化樣品混于37.5 mL模擬胃環(huán)境的電解質(zhì)溶液中(含6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2(H2O)6、0.5 mmol/L (NH4)2CO3),并于電解液中加入25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液,精密量取一定體積1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)混合液pH 2.3,并記錄鹽酸用量V(HCl),隨后加入(4.475-V(HCl))mL蒸餾水,最后加入8 mL胃蛋白酶(25 000 U/mL),使最終消化液中蛋白酶達(dá)2 000 U/mL,上述樣品及試劑在混合前均需在37 ℃條件下預(yù)熱30 min。將配制好的混合液置于37 ℃水浴振蕩搖床中進(jìn)行胃部消化反應(yīng)1.5 h,并實時監(jiān)控pH值恒定。體外消化過程中,分別于第0、5、15、30、45、60、90分鐘處進(jìn)行抽樣檢測以探究消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征及蛋白解離機(jī)制,各消化終點處采用0.5 mol/L NaHCO3將消化液pH 7.0終止反應(yīng)。消化液高速離心去除不溶性蛋白沉淀,取上清液,冷凍干燥,備用。

        1.3.7 蛋白水解度測定

        采用TCA沉淀法測定蛋白水解度。TCA屬于典型蛋白沉淀劑之一,能夠使大分子蛋白及較大肽段沉淀。隨消化進(jìn)行,蛋白的肽鏈被蛋白酶水解成大小不等的片段,此時在TCA中溶解指數(shù)增大。針對特定反應(yīng)底物而言,TCA能夠定性反映出蛋白水解程度,其溶解指數(shù)越大,代表被水解生成的短肽鏈越多。本實驗以TCA可溶解性氮含量表征蛋白水解度,在各消化取樣點處取消化液適量,隨后立即與等體積10% TCA溶液混合以沉淀未消化的大分子質(zhì)量蛋白?;旌弦红o置10 min后于8 000×g離心15 min。采用微量凱氏定氮(N×6.25)測定沉淀及其他蛋白樣品對應(yīng)的氮含量。蛋白質(zhì)水解度計算公式如下[21]:

        式中:DH為水解度/%;N0為消化前蛋白樣品中TCA-沉淀氮含量/mg;Nt為消化t min后TCA-沉淀氮含量/mg;Ntot為蛋白樣品中總氮含量/mg。

        1.3.8 蛋白質(zhì)亞基組成的測定

        參考Laemmli等[22]的方法并稍加修改。將20 μL樣品稀釋后置于含β-巰基乙醇的2×上樣緩沖液中,并于95 ℃加熱90 s做變性處理。分別配制15%分離膠與5%濃縮膠,上樣量為10 μL,電泳過程電壓恒定,濃縮膠電壓60 V,分離膠電壓120 V。染色劑為0.25 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250(0.25 g考馬斯亮藍(lán)R-250,400 mL甲醇、70 mL冰乙酸定容至1 L),電極液為14.41 g甘氨酸、3.03 g Tris、1.0 g SDS定容至1 L,脫色液A為甲醇-冰乙酸-水(40∶7∶53,V/V),脫色液B為甲醇-冰乙酸-水(5∶7∶88,V/V)。電泳膠片采用GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

        1.3.9 體外模擬消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布分析

        利用體積排阻色譜-高效液相色譜法測定水解蛋白肽的分子質(zhì)量分布。將經(jīng)胃蛋白酶水解的蛋白離心分離取上清液,稀釋后過0.45 μm濾膜。排阻色譜柱(300 mm×4.6 mm,2.7 μm);流動相:150 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH 7.0;樣品進(jìn)樣量10 μL,流動相流速0.3 mL/min,紫外檢測波長220 nm,柱溫25 ℃,運行樣品30 min。相對分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品:牛血清白蛋白(67 000 Da)、雞白蛋白(44 000 Da)、核糖核酸酶(13 700 Da)、胰島素(5 500 Da)、VB12(1 350 Da)。

        1.3.10 蛋白空間構(gòu)象測定

        1.3.10.1 圓二色譜分析

        以圓二色譜法測定樣品中蛋白二級結(jié)構(gòu)變化,將樣品溶于0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)中稀釋,使蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。25 ℃、以100 nm/min掃描速率在190~260 nm范圍內(nèi)掃描,樣品池光程1 mm,分辨率0.1 nm。采用“CDPro”曲線擬合軟件對數(shù)據(jù)處理分析求得二級結(jié)構(gòu)含量,每組樣品重復(fù)測定3 次。

        1.3.10.2 熒光光譜分析

        參考江連洲等[23]方法并稍作修改。待測樣品用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋,使樣品蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg/mL[24]。熒光發(fā)射光譜分析時采用蛋白分子內(nèi)色氨酸熒光基團(tuán)作探針,激發(fā)波長290 nm,測定波長范圍為300~450 nm,掃描速率240 nm/s,激發(fā)條帶寬度10 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均10 nm,每組樣品重復(fù)測定3 次。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        每組實驗均重復(fù)3 次,結(jié)果表示為 ±s,使用Statistics 8進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析(P<0.05為顯著性差異)。采用Origin 8.5等軟件對數(shù)據(jù)、圖表進(jìn)行處理分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 純化花青素質(zhì)量濃度確定

        圖1 純化花青素色譜圖Fig. 1 Chromatogram of purified anthocyanin

        如圖1所示,黑米提取物中花青素主成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷,為方便計算,將矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度視為花青素質(zhì)量濃度做近似處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算最終花青素純度為(91.23±0.02)%,可認(rèn)為純品,相對分子質(zhì)量按449.38計算。矢車菊素-3-葡萄糖苷峰[25]的保留時間為25.799 min,將該峰面積3 128 521代入標(biāo)曲求得純化后花青素質(zhì)量濃度約為50 mg/mL。

        2.2 SPI體外消化水解度

        圖2 添加不同質(zhì)量花青素后SPI體外消化水解度Fig. 2 Change in TCA solbule nitrogen content during in vitro digestion of SPI with different concentrations of anthocyanin added

        模擬胃液消化過程中,蛋白多肽被逐漸水解,蛋白水解程度顯著,說明蛋白對胃蛋白酶較敏感。由圖2可知,隨消化時間延長,蛋白水解度逐漸增加,且在最初消化的30 min內(nèi)水解度增加尤為顯著,消化60 min后水解趨于穩(wěn)定,這是樣品底物質(zhì)量濃度及酶活隨反應(yīng)進(jìn)行而降低,復(fù)合物經(jīng)初始階段積累達(dá)到穩(wěn)態(tài),并趨于恒定等原因造成的[26]。研究表明,隨樣品中花青素質(zhì)量增加,蛋白質(zhì)消化率呈下降趨勢,且花青素質(zhì)量配比越大,蛋白水解受到的影響越大??瞻捉M蛋白在經(jīng)90 min消化后,水解度高達(dá)48.5%;SPI與花青素質(zhì)量比為1∶0.01時蛋白最終水解度為45.8%,水解度降低不明顯;質(zhì)量比為1∶0.02時水解度為42%,但增加至1∶0.05的質(zhì)量比時蛋白的水解度顯著降低,僅有36.5%。這表明花青素的添加對蛋白消化具有一定不利影響,推測是由于SPI與花青素發(fā)生結(jié)合并使自身空間結(jié)構(gòu)發(fā)生部分程度變化導(dǎo)致的。同時,花青素等多酚類物質(zhì)還具有一定程度沉淀蛋白質(zhì)的特性[27],由于SPI主要由球蛋白組成,這種蛋白質(zhì)分子極性基團(tuán)朝向外部,可以與極性水分子相互作用,添加花青素后,可能由于SPI的側(cè)鏈氨基酸極性基團(tuán)與花青素的酚羥基結(jié)合,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子體系極性下降,溶解度降低。而蛋白質(zhì)的溶解性又與其功能、加工及消化特性等息息相關(guān),因此花青素對蛋白的沉淀性也是對蛋白水解度產(chǎn)生影響的因素之一。酚類化合物絡(luò)合對蛋白水解度的影響與酚類化合物及蛋白種類和性質(zhì)等多因素有關(guān),兩者互作對各自的影響也是一個相對復(fù)雜的過程。

        2.3 SPI及其消化產(chǎn)物亞基組成分析

        圖3 SPI及SPI-花青素復(fù)合物中蛋白體外消化SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE analysis of in vitro pepsin digests of SPI and SPI-anthocyanins complexs

        如圖3所示,添加不同質(zhì)量花青素的蛋白樣品中各組分受胃蛋白酶的降解情況有顯著差別。4 組樣品中的β-伴大豆球蛋白相較于大豆球蛋白更易于被胃蛋白酶酶解,且大豆球蛋白在經(jīng)過連續(xù)90 min的消化后也僅有部分被酶解。除圖3a樣品外,其余樣品經(jīng)胃蛋白酶酶解60 min后,α’-亞基及α-亞基的電泳條帶對應(yīng)組分完全被消化降解,圖3a樣品在經(jīng)過連續(xù)消化90 min后該處組分仍有部分未能被降解。針對大豆球蛋白而言,相對不易被消化,降解程度也較小,其A1~A4亞基及B亞基僅在圖3a樣品中有稍明顯水解,從而降解為相對分子質(zhì)量小于17 kDa的蛋白肽。而對另外3 組樣品而言,大豆球蛋白的消化皆不明顯。

        SDS-PAGE顯示,添加不同質(zhì)量花青素的樣品中蛋白消化程度具有較顯著區(qū)別。對照組圖3a中蛋白消化水解相對徹底,隨著花青素添加量的增多,蛋白質(zhì)整體消化程度逐漸降低,具體表現(xiàn)為花青素的添加促進(jìn)了以α-亞基條帶組分為代表的β-伴大豆球蛋白亞基的消化,但卻顯著抑制了大豆球蛋白中各亞基組分消化,且尤以圖3d中花青素添加量為最大時對蛋白消化影響最為顯著,這與圖2中蛋白質(zhì)水解度的測定結(jié)果相吻合。胃蛋白酶對不同蛋白組分的消化情形與其空間結(jié)構(gòu)緊密相關(guān),花青素的添加部分程度改變了蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu),最終使其添加對蛋白的水解消化產(chǎn)生了一定不利影響。

        然而,即使花青素的添加部分程度的降低了蛋白水解度,但由圖3可看出,花青素以上述任何比例添加進(jìn)蛋白樣品時,都能夠有效促進(jìn)7S球蛋白中α-亞基的水解,而據(jù)相關(guān)研究表明,α-亞基為大豆蛋白致使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主致敏原之一[28],且經(jīng)蛋白酶體外酶解可以部分去除該亞基組分[29],因而推測花青素對7S球蛋白消化的促進(jìn)作用能夠降低大豆蛋白致敏性,該結(jié)論對大豆蛋白相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)加工具有一定的積極作用。

        2.4 SPI及其消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布分析

        因體積排阻色譜柱的填料凝膠含大量微孔,所以樣品在經(jīng)過體積排阻色譜柱時,僅其中分子質(zhì)量較小的組分及緩沖溶液得以通過,進(jìn)而使較大分子質(zhì)量組分被阻擋于外部,因此樣品在填料間隙內(nèi)流動時較大分子質(zhì)量組分首先被洗脫,小分子質(zhì)量組分隨后被洗脫[30]。

        根據(jù)最小二乘法計算出該蛋白標(biāo)曲回歸方程:y=-2.002 6x+17.620,其中x為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量對數(shù),y為洗脫時間。利用該式即可根據(jù)蛋白樣品的分子質(zhì)量估算出對應(yīng)組分的洗脫時間。各蛋白樣品及消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布如表1所示。

        表1 未添加花青素的SPI消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mas distribution of SPI hydrolysates

        SPI主要是由7S和11S兩種球蛋白組成,7S的分子質(zhì)量范圍在150~200 kDa,由3 個亞基組成,亞基的分子質(zhì)量范圍在42~83 kDa之間;11S的分子質(zhì)量范圍在300~380 kDa之間,由6 個亞基組成,每個亞基由一個酸性多肽和一個堿性多肽組成,多肽的分子質(zhì)量范圍在10~35 kDa之間。蛋白體外模擬消化進(jìn)程中,分子質(zhì)量變化是一個動態(tài)過程,蛋白由際水解為胨,最后被徹底水解為小分子肽。由表1可知,未水解的大豆蛋白分子質(zhì)量主要集中在10 kDa以上,特別以分子質(zhì)量高于100 kDa蛋白居多,比例高達(dá)83.12%。而此時,分子質(zhì)量在3~10 kDa之間的小肽含量微乎其微。隨消化進(jìn)行,分子質(zhì)量100 kDa以上蛋白比例逐漸減小,在消化至15~30 min時其含量大幅度降低,并于消化終點時比例降至29.93%。同時,分子質(zhì)量分布為10~100 kDa的蛋白肽含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,這可能由于在消化初期,分子質(zhì)量100 kDa以上蛋白逐漸被消化,致使分布為10~100 kDa的蛋白肽含量有所增加,隨著消化反應(yīng)進(jìn)行,分布在10~100 kDa的蛋白肽也進(jìn)一步被水解成更小的肽片段,而大于100 kDa以上蛋白隨后水解的更為徹底造成的,這也使得3~10 kDa及小于3 kDa的蛋白肽含量有較為明顯的上升。最終,蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要集中在3~100 kDa之間,這與SDS的分析結(jié)果一致。

        表2 SPI-花青素(1∶0.01)消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.01) complex

        表3 SPI-花青素(1∶0.02)消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.02) complex

        表4 SPI-花青素(1∶0.05)消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.05) complex

        通過對表2~4與表1比較發(fā)現(xiàn),在未消化的4 種樣品中,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要都集中在100 kDa以上,且所占比例相似。隨消化時間延長,大于100 kDa的蛋白逐漸被消化,且消化均在30 min內(nèi)較明顯,但添加的花青素量越大,各消化時間點對應(yīng)的消化產(chǎn)物中該分子質(zhì)量蛋白所占比例的降低越不顯著,這主要是由于花青素的添加,降低了蛋白水解程度。消化初期,各樣品中低于10 kDa分子質(zhì)量的蛋白肽含量均很少,隨著反應(yīng)進(jìn)行,大分子質(zhì)量蛋白逐級水解,消化終點處,空白組中10 kDa以下蛋白肽含量增加至35%,添加花青素的蛋白樣品中其含量也有所增加,但消化最不明顯的樣品組其含量只增加至20%,同時各樣品中蛋白肽分子質(zhì)量多集中在3~10 kDa之間。10~100 kDa分子質(zhì)量肽段均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,主要由于消化初期,高于100 kDa的蛋白初步水解成10~100 kDa分子質(zhì)量肽段,而后期則是因100 kDa以上的蛋白及10~100 kDa分子質(zhì)量多肽進(jìn)一步水解使其含量降低,也因此使得更小分子的肽含量有所增加,但花青素添加量的增多,導(dǎo)致最終水解產(chǎn)生的小分子肽含量降低,這也是由于底物受花青素影響水解不夠徹底造成的,這與SDS的分析結(jié)果也是相吻合的。

        2.5 大豆蛋白及消化產(chǎn)物空間構(gòu)象分析

        2.5.1 SPI及消化產(chǎn)物圓二色譜分析

        圖4 未消化大豆蛋白(a)和體外模擬消化后大豆蛋白(b)樣品的圓二色譜圖Fig. 4 CD spectra of SPI (a), SPI-anthocyanin complexes and hydrolysates (b)

        表5 圓二色譜測定天然及SPI-花青素復(fù)合物中大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Table 5 Secondary structure contents in SPI and SPI-anthocyanin complexes%

        表6 圓二色譜測定不同質(zhì)量比花青素復(fù)合的SPI消化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)含量Table 6 Secondary structure contents in digests of SPI and SPI-anthocyanin complexes%

        圓二色譜是一種高效而精確定性定量分析蛋白二級結(jié)構(gòu)的常用手段,能夠在液體蛋白樣品中進(jìn)行直接測定[31]。本實驗選擇能夠反映肽鍵圓二色性的遠(yuǎn)紫外區(qū)(190~260 nm)光譜條件,對天然及與花青素復(fù)合后的SPI經(jīng)1.5 h體外模擬消化前后的蛋白樣品進(jìn)行圓二色譜分析。圖4a為天然及與花青素復(fù)合后的蛋白圓二色譜圖,圖4b所示為體外模擬消化后大豆蛋白圓二色譜圖,SPI與花青素復(fù)合后二級結(jié)構(gòu)含量變化見表5,對應(yīng)消化產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)變化見表6。在205 nm和217 nm波長處的摩爾橢圓度有兩個最小值,在190~195 nm附近有一最大正值,該值為蛋白質(zhì)α-螺旋的典型特征峰。圖4a顯示隨著花青素添加量的增多,α-螺旋的典型特征峰逐漸降低,表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。圖4b中在190~195 nm左右處的橢圓率顯著降低,表明在消化過程中α-螺旋結(jié)構(gòu)有較明顯損失。同時,當(dāng)?shù)鞍姿鈺r,217 nm波長處的橢圓率負(fù)值有所減少,這也表明蛋白二級結(jié)構(gòu)被破壞[32]。由表6可知,SPI與花青素復(fù)合后,α-螺旋含量降低,β-折疊含量遞增,β-轉(zhuǎn)角含量高低浮動整體無明顯變化,無規(guī)則卷曲含量升高,這些現(xiàn)象可能是由于花青素結(jié)合到了SPI α-螺旋中的某些氨基酸區(qū)域,進(jìn)而蛋白分子部分展開,空間構(gòu)象被改變所致,且該現(xiàn)象在花青素質(zhì)量配比增大后更顯著。謝鳳英等[33]研究表明,多酚化合物的添加會使米糠蛋白的α-螺旋含量降低,β-折疊結(jié)構(gòu)含量先升高后降低,而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量增加,這與本實驗結(jié)果一致。同時,也有相關(guān)研究表明,綠原酸、阿魏酸與香豆酸(香豆酸)等酚類物質(zhì)同α-乳白蛋白及β-乳球蛋白互作,能夠降低α-螺旋含量,增加β-折疊和轉(zhuǎn)角含量。天然及添加花青素的蛋白樣品消化后,α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)含量均降低,且花青素質(zhì)量配比越大,消化后α-螺旋及β-折疊含量降低值越小,蛋白二級結(jié)構(gòu)變化越不明顯,推測是因各花青素與蛋白復(fù)合,可能在某種程度上影響蛋白酶解程度,使各酶解產(chǎn)物與對應(yīng)未消化樣品間的空間構(gòu)象存在不同程度的差異。消化30 min時,α-螺旋及β-折疊含量降低較明顯(表中未給出),表明兩者的消化水解主要發(fā)生于反應(yīng)初期,并推斷α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的消化可能增加了無規(guī)卷曲的含量,各結(jié)構(gòu)間可能存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。

        2.5.2 SPI及消化產(chǎn)物熒光光譜分析

        圖5 同一蛋白樣品不同消化時間熒光譜圖Fig. 5 Fluorescence emission spectra of digested SPI samples at different periods

        圖6 不同蛋白樣品同一消化時間熒光譜圖Fig. 6 Fluorescence emission spectra of digested SPI-anthocyanin complexes at each period

        蛋白質(zhì)分子可解離的基團(tuán)除氨基和羧基外,還有大量凸出的側(cè)鏈基團(tuán),如組氨酸的咪唑,酪氨酸的羥基等。消化過程中蛋白質(zhì)主側(cè)結(jié)構(gòu)解離與重聚的變化能夠使蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的電離情況發(fā)生變化,從而使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此通過研究不同消化程度的消化產(chǎn)物中蛋白熒光性質(zhì)變化,可以得出不同消化程度條件下大豆蛋白三級結(jié)構(gòu)改變的信息。290 nm波長處激發(fā)產(chǎn)生的熒光光譜主要是由蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基發(fā)射的,色氨酸殘基是蛋白質(zhì)的主要內(nèi)源熒光源,通過記錄色氨酸的熒光圖譜,以反映色氨酸殘基所處微環(huán)境變化情況,從而揭示出在不同體外模擬消化時間內(nèi)花青素質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響。

        如圖5所示,各樣品的SPI在連續(xù)1.5 h的消化過程中,λmax均分布在346.6~350.6 nm內(nèi),且隨消化時間延長,消化產(chǎn)物的λmax整體呈紅移趨勢,表明蛋白在消化過程中逐漸解離,蛋白分子內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)暴露在外部極性環(huán)境中;也有部分暴露于分子外部極性環(huán)境的色氨酸殘基轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部非極性環(huán)境中,蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。由圖6可知,未消化樣品中,隨花青素添加量增大,大豆蛋白最大熒光發(fā)射波長λmax發(fā)生紅移,由346.2 nm偏移至350.2 nm,說明花青素與大豆蛋白發(fā)生了結(jié)合,從而改變了蛋白構(gòu)象,色氨酸微環(huán)境發(fā)生改變,由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境,肽鏈結(jié)構(gòu)舒展。任一相同消化點時,隨花青素質(zhì)量配比的增加,消化產(chǎn)物的λmax均逐漸發(fā)生紅移,這與花青素質(zhì)量配比增加,樣品中—OH基團(tuán)增多有關(guān),同時,也是由于更多的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的舒展導(dǎo)致[34]。

        此外,花青素質(zhì)量配比的增加會導(dǎo)致蛋白樣品在任一相同消化時間點的蛋白熒光強(qiáng)度降低,特別是SPI與花色素質(zhì)量比為1∶0.05時,這也說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,花青素與色氨酸殘基間發(fā)生了互作而削弱了SPI的熒光強(qiáng)度[34]。

        3 結(jié) 論

        體外模擬消化實驗表明,隨消化時間延長,大豆蛋白消化程度逐漸增加,且水解主要發(fā)生在消化前30 min?;ㄇ嗨氐奶砑訒档偷鞍踪|(zhì)水解度,且花青素質(zhì)量配比越大,抑制消化效果越明顯。

        采用SDS-PAGE對各蛋白樣品及消化產(chǎn)物進(jìn)行亞基組成分析,表明胃蛋白酶對蛋白各組分消化性能有較顯著差異,7S較11S球蛋白更易被消化,花青素的添加抑制11S蛋白水解,卻能夠有效促進(jìn)大豆蛋白主要致敏原α-亞基降解,推測花青素的添加可有效降低大豆蛋白食用致敏性。

        利用排阻色譜分析蛋白樣品及消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布,結(jié)果表明,隨消化反應(yīng)的進(jìn)行,大分子質(zhì)量蛋白逐漸被水解成小分子肽,最終分子質(zhì)量分布集中在3~100 kDa之間,同時花青素的添加使得最終消化產(chǎn)物分布在3 kDa以下的蛋白肽含量減少,這與SDS-PAGE分析結(jié)果一致。

        圓二色譜分析結(jié)果表明,花青素改變了SPI構(gòu)象,主要表現(xiàn)在α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低,β-折疊含量增加,β-轉(zhuǎn)角變化無明顯規(guī)律,無規(guī)則卷曲含量增加,構(gòu)象的變化對蛋白的消化過程及水解度產(chǎn)生一定程度影響,從而造成消化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)也被不同程度的改變。

        熒光分析表明,蛋白及消化產(chǎn)物中,色氨酸殘基分布于蛋白分子外極性環(huán)境中,且隨花青素質(zhì)量配比增加,消化產(chǎn)物的λmax逐漸紅移。大豆蛋白在消化過程中逐漸被解離,熒光基團(tuán)暴露于溶劑中,但花青素的添加對蛋白有顯著熒光猝滅效果。

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