韓 浩 宣麗穎 白冬松 宋葆華 寶魯爾

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028005)

多發(fā)性硬化(MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的自身免疫病，發(fā)病群體以中青年居多，但老年病例也較為常見。星形膠質(zhì)細(xì)胞是MS病理變化中重要的靶細(xì)胞，常受累及的細(xì)胞分布于腦室周圍白質(zhì)、脊髓、腦干和小腦等〔1〕。該病以病灶多發(fā)性和病程的時(shí)間多發(fā)性為主要特點(diǎn)。目前，MS治療手段較為局限，相關(guān)研究顯示干擾素(IFN)γ對(duì)于控制青年及老年MS的進(jìn)展有著重要作用〔2〕。其中，IFNγ對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用機(jī)制值得深入研究。本研究擬通過(guò)檢測(cè)干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)1及NLRC5來(lái)探討IFNγ促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路的激活作用。

1 材料與方法

1.1星形膠質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)及IFNγ的作用 人星形膠質(zhì)細(xì)胞株購(gòu)置于齊氏生物科技公司，細(xì)胞培養(yǎng)采用人神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒(Human Brain Prima CellTM：Normal Nerve Astrocytes Cells Cat No.3-0505)進(jìn)行，所有操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱。獲得足夠的細(xì)胞后用EDTA消化細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整在3× 104/cm2。實(shí)驗(yàn)組加入IFNγ至終濃度為250 IU/ml，空白對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2Western印跡 離心獲得實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組的檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞樣品先加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解。然后將兩組獲得的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，進(jìn)而將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)膜到聚偏氟二乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)膜后加入封閉液在室溫下封閉60 min。4℃下，分別加入多克隆山羊抗人的IRF1及NLRC5的IgG一抗(RD公司，1∶200稀釋)孵育60 min。二抗加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗山羊的IgG孵育60 min，加入洗滌液5～10 min洗滌3次。內(nèi)參照物采用β-actin。使用BeyoECL Plus(P0018)檢測(cè)蛋白，顯影成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

Western印跡結(jié)果顯示，終濃度為250 IU/ml IFNγ刺激體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞株與未加入IFNγ刺激的空白對(duì)照組相比，IRF1及NLRC5的水平顯著提高(P<0.05)，見表1，由此可見，IFNγ對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路的IRF1及NLRC5的有潛在的調(diào)節(jié)作用。

表1 Western印跡檢測(cè)兩組IRF1、NLRC5表達(dá)比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

3 討 論

IRF1是一種核轉(zhuǎn)錄因子(NF)〔3〕。NLRC5蛋白分子表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)也是一種重要的模式識(shí)別受體(PRRs)，參與抑制炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)〔4〕。二者均是JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路的重要信號(hào)。NLRC5作為NF-κB和Ⅰ型IFN途徑的關(guān)鍵抑制分子，NLRC5能有效調(diào)控免疫細(xì)胞的活性。本研究顯示，IFNγ可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路的IRF1及NLRC5的表達(dá)，提示這兩個(gè)關(guān)鍵蛋白可能參與IFNγ對(duì)MS的治療過(guò)程。星形膠質(zhì)細(xì)胞JAK1/STAT3細(xì)胞信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)在炎癥及出血性疾病中活化，從而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被廣泛關(guān)注〔5〕。

JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典模式的優(yōu)點(diǎn)在于其簡(jiǎn)單性，因?yàn)榧?xì)胞核中的JAK激活的STAT負(fù)責(zé)特定的基因激活。許多配體包括生長(zhǎng)因子和激素使用相同的STAT轉(zhuǎn)錄因子〔6〕。但在細(xì)胞、組織和器官水平上發(fā)揮不同功能。本研究證實(shí)復(fù)雜的IFN信號(hào)與類固醇激素(SH)/類固醇受體(SR)信號(hào)傳導(dǎo)具有相似性，都有JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典模式的激活。IFN信號(hào)傳導(dǎo)都涉及復(fù)合配體，特異性激活相關(guān)基因的啟動(dòng)子，活化的JAK和活化的STAT。它們可能都通過(guò)參與特異性基因激活和表觀遺傳重塑，從而改變MS的進(jìn)程〔7〕。受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在結(jié)合IFN的C末端中起重要作用，這是我們進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。因此，IFN信號(hào)傳導(dǎo)的研究提供了對(duì)這種信號(hào)傳導(dǎo)的特異性和MS發(fā)展和治療機(jī)制的深入了解。

包括在MS動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的研究，JAK/STAT途徑還參與許多細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，并且對(duì)于免疫應(yīng)答的發(fā)展，調(diào)節(jié)和終止是關(guān)鍵的靶點(diǎn)〔8〕。 所以，JAK/STAT途徑的調(diào)節(jié)對(duì)自身免疫和神經(jīng)炎癥疾病具有重要的病理學(xué)意義。參與MS/EAE的許多細(xì)胞因子，包括IL-6，IL-12，IL-23，IFNγ和GM-CSF，通過(guò)JAK/STAT途徑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。因此，在IFNγ研究的基礎(chǔ)上，靶向JAK對(duì)治療神經(jīng)的自身免疫性炎癥已經(jīng)顯示了非常廣闊的前景〔9〕。AZD1480處理通過(guò)阻止免疫細(xì)胞進(jìn)入大腦，抑制Th1和Th17細(xì)胞分化，使骨髓細(xì)胞失活，抑制大腦中的STAT活化及減少促炎癥的表達(dá)，進(jìn)而控制膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白誘導(dǎo)的經(jīng)典和非典型脊髓炎模型的病情轉(zhuǎn)歸。用AZD1480抑制JAK/STAT途徑在MS的多個(gè)臨床前模型中具有臨床功效，表明JAK/STAT途徑作為神經(jīng)炎癥疾病的靶標(biāo)可行性〔10〕。

MS及EAE動(dòng)物模型的特征是局灶性炎癥浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，脫髓鞘病變，軸突損傷及激活免疫細(xì)胞和損傷神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-12，IL-6，IL-17，IL-21，IL-23，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IFNγ。JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)這些細(xì)胞因子的生物活性，并且對(duì)免疫應(yīng)答的發(fā)展和調(diào)節(jié)至關(guān)重要。JAK/STAT途徑在MS/EAE中異常激活，因?yàn)榧?xì)胞因子過(guò)量產(chǎn)生，負(fù)調(diào)節(jié)因子如細(xì)胞因子信號(hào)蛋白抑制因子的表達(dá)缺失。除了IFNγ外，特定的JAK/STAT抑制劑已經(jīng)用于許多MS的臨床前模型中，并且證明了對(duì)疾病的臨床過(guò)程和先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的減弱的有益作用。此外，其他藥物如他汀類，醋酸格拉替雷，拉喹莫德和富馬酸鹽具有有益效果，都有潛在的抑制JAK/STAT途徑的作用〔11〕。

CK2是一種高度保守和多效的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可促進(jìn)許多促存活和促炎癥信號(hào)通路，包括PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT。CK2特異性地抑制小鼠和人Th17細(xì)胞分化，同時(shí)促進(jìn)Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的產(chǎn)生。Th17/Treg軸和Th17細(xì)胞的成熟是許多自身免疫性疾病(包括MS)的發(fā)病機(jī)制的主要促成因素。相關(guān)結(jié)果表明CK2是Th17/Treg軸和Th17細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)因子，并且表明CK2可以靶向治療Th17細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的自身免疫疾病〔12～14〕。miR-141和miR-200a可能是通過(guò)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化和抑制向Treg細(xì)胞分化而在MS癥狀進(jìn)展中的關(guān)鍵miRNA〔15〕。這些miRNA可能抑制Th17細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，從而促進(jìn)其分化。進(jìn)一步研究IFNγ對(duì)這些miRNA的調(diào)節(jié)將會(huì)更深入的解釋IFNγ對(duì)MS的治療機(jī)制。總之，本研究結(jié)果及相關(guān)研究進(jìn)展提示IFNγ對(duì)JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)通路，以及相關(guān)miRNA及Th17/Treg的調(diào)節(jié)，可能成為未來(lái)利用IFNγ及其他免疫療法治療多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病的有效的分子靶點(diǎn)。