呂錫芳 陳志剛 何雄偉

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000)

尋找能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制其進(jìn)展的藥物或因子，對于臨床上治療卵巢癌具有重要意義。硫化氫(H2S)廣泛分布于心血管、內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)等組織〔1〕。研究顯示，內(nèi)源性或外源性 H2S 能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡〔2～4〕，但其具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而H2S可通過p38MAPK信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡。本課題組觀察H2S對人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并探討p38MAPK 信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株(購自中科院上海細(xì)胞庫)。磷酸鹽緩沖液(PBS，上海生工)、碘化丙啶(Sigma公司)、NaHS(Sigma公司)、SB203580(德國Merck公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，無支原體胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)、RNA酶(上海生工生物公司),AnnexinV/PI雙染試劑盒(Invitrogen公司)、四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(Sigma公司)。

1.2儀器與設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細(xì)胞儀(德國Partec公司)、酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶(含0.04%)消化細(xì)胞,按1∶4傳代繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代周期穩(wěn)定后即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 SKOV3細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁，去除培養(yǎng)基，無血清RPMI1640同步化24 h后，分為正常對照組，NaHS(0.01 mol/L)組，SB203580(0.1 mol/L)組，NaHS聯(lián)合SB203580組，正常對照組加入同體積的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基, 在5%CO2、37℃飽和濕度條件下干預(yù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3MTT法檢測各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖情況 SKOV3細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)(以5×104個(gè)/ml)，200 μl/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，加入無血清RPMI1640同步化24 h，然后按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組結(jié)束干預(yù)前4 h,每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml),繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h,棄上清，加入DMSO 150 ml/孔，室溫避光振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(A490)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)無細(xì)胞對照作為空白調(diào)零組,以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率(IR)=(A對照組值-A實(shí)驗(yàn)組值)/(A對照組值)×100%。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期分布情況 SKOV3細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(5×105個(gè)/ml)，2 ml/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，用無血清RPMI1640同步化24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后消化收集細(xì)胞，用預(yù)先凍存的70%冰乙醇重懸細(xì)胞，吹打混勻，4℃固定過夜，過夜后離心去除乙醇，PBS 洗滌3遍，再用500 μl PBS 重懸細(xì)胞，加入 RNAseA,使其終濃度為250 μg/ml,于37℃孵育30 min,然后加入5 μl碘化丙啶染液,37℃避光保存 30 min ，上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按以下公式計(jì)算系膜細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=S期和G2/M期細(xì)胞比例之和/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例之和。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡情況 收集對數(shù)期人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，以5×105個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi)，2 ml/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，無血清RPMI1640同步化24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照AnnexinV/PI 雙染法凋亡試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組人卵巢癌細(xì)胞增殖情況(MTT法) 與正常對照組比較，經(jīng)藥物干預(yù)處理48 h后NaHS組、SB203580組、NaHS聯(lián)合SB203580組人SKOV3細(xì)胞IR均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。NaHS組與SB203580組人SKOV3細(xì)胞IR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而NaHS聯(lián)合SB203580組人SKOV3細(xì)胞IR較NaHS組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而與SB203580組比較，NaHS聯(lián)合SB203580組人SKOV3細(xì)胞抑制率亦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 MTT法檢測各組干預(yù)48 h后對人卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與NaHS組比較：2)P<0.01；與SB203580組比較：3)P<0.01

2.2各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期分布情況 各組經(jīng)藥物干預(yù)48 h后，NaHS組、SB203580組、NaHS聯(lián)合SB203580組G0/G1期細(xì)胞比例均較正常對照組明顯增加，S期細(xì)胞比例均較正常對照組明顯減少(均P<0.01)。與NaHS組比較，SB203580組各細(xì)胞周期時(shí)相分布與差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),NaHS聯(lián)合SB203580組G0/G1期細(xì)胞顯著增加，S期細(xì)胞顯著減少(均P<0.01)。NaHS聯(lián)合SB203580組G0/G1期細(xì)胞比例較SB203580組顯著增加，S期細(xì)胞比例較SB203580組顯著減少(均P<0.01)。見表2。

表2 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期分布情況

2.3各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的情況 與正常對照組〔(2.77±0.75)%〕比較, NaHS組〔(7.14±0.56)%〕、SB203580組〔(6.52±0.63)%〕、NaHS聯(lián)合SB203580組細(xì)胞凋亡率〔(10.54±2.08)%〕均顯著增加(均P<0.01)。與NaHS組比較，SB203580組細(xì)胞凋亡率無顯著增加或降低(P>0.05),NaHS聯(lián)合SB203580組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。NaHS聯(lián)合SB203580組細(xì)胞凋亡率較SB203580組亦顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

卵巢癌因其發(fā)病隱匿，治愈困難而成為病死率最高的婦科惡性腫瘤。雖然目前手術(shù)及放化療等傳統(tǒng)治療手段不斷改進(jìn),但其總5年生存率仍<30%。因此，尋找能夠抑制或消滅卵巢癌細(xì)胞的藥物或因子，對臨床上治療卵巢癌具有重要的意義。 在哺乳動物細(xì)胞中H2S經(jīng)胱硫醚裂解酶、胱硫醚β合成酶和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化產(chǎn)生〔6〕。其在體內(nèi)以H2S氣體和NaHS形式存在。Yan等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，低劑量NaHS(30～50 μmol/L)可減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基的生成，提高細(xì)胞生存率，而高濃度NaHS(1 mmol/L)能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Abrahamsen等〔8〕研究表明，H2S可以啟動凋亡機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。本研究表明NaHS能誘導(dǎo)人卵巢癌的凋亡。 p38MAPK信號通路活化可以抑制多種細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖，在細(xì)胞增殖與凋亡中起重要作用。Keuling等〔9〕用SB203580特異性阻斷P38MAPK通路能夠增強(qiáng)ABT-737誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞凋亡。本研究表明p38MAPK信號通路可能參與了人卵巢癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，當(dāng)此通路被抑制后，人卵巢癌細(xì)胞的增殖亦被顯著抑制。且SB203580可協(xié)同NaHS抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，兩種藥物具有協(xié)同作用。因此，我們推斷，p38MAPK信號通路被阻斷時(shí)，NaHS抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用被激活，協(xié)同NaHS對促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用共同延緩卵巢癌的發(fā)展。