閔 文 韓 龍 韓詩(shī)雨 尚宜志 吳銘杰 方彭華 袁 翰 黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

骨質(zhì)疏松(OP)是以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加進(jìn)而易發(fā)生骨折的一種全身性骨代謝疾病〔1〕。隨著生活水平的提高，人口老齡化日趨明顯。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有老齡人口約1.3億,OP患者達(dá)8 400萬(wàn)人，預(yù)計(jì)到2050年，我國(guó)老齡人口將達(dá)到2.5億，其中25%～70%可能患有OP〔2〕。絕經(jīng)后婦女患OP高達(dá)40%〔3〕，世界范圍內(nèi)每年因OP引起的骨折有900萬(wàn)例〔4〕。OP已成為亟待解決的嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。細(xì)胞核因子κΒ受體活化因子配體(RANKL)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)成熟破骨細(xì)胞的活力，阻止破骨細(xì)胞凋亡，是破骨細(xì)胞分化成熟和維持功能所需的重要因子。骨保護(hù)素(OPG)蛋白能明顯抑制破骨細(xì)胞的形成，并引起骨密度(BMD)的升高〔1〕。在骨組織中，OPG作為一種誘騙受體，可以競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，從而阻止RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟〔5，6〕。因此，RANKL/OPG的比值對(duì)破骨細(xì)胞的分化有著直接影響。補(bǔ)腎通絡(luò)方是基于臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究得到的經(jīng)驗(yàn)方，該方對(duì)OP患者及OP大鼠的骨量減少都有改善〔7，8〕。但是，目前對(duì)于補(bǔ)腎通絡(luò)方影響骨吸收的機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立去卵巢OP模型大鼠，觀察補(bǔ)腎通絡(luò)方對(duì)大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及骨代謝相關(guān)因子RANKL/OPG的影響，探討補(bǔ)腎通絡(luò)方對(duì)OP大鼠骨吸收的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及材料 6月齡SD系SPF級(jí)雌性大鼠104只，體重260～280 g。動(dòng)物購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。中藥：補(bǔ)腎基礎(chǔ)方、通絡(luò)方、補(bǔ)腎通絡(luò)方均由江蘇省中醫(yī)院制劑室提供，含生藥1.0 g/ml。補(bǔ)腎基礎(chǔ)方:淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、茯苓、白芍、甘草等組成。通絡(luò)方:蜈蚣、全蝎等組成。補(bǔ)腎通絡(luò)方:淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、蜈蚣、全蝎、茯苓、白芍、甘草等組成。西藥：阿侖膦酸鈉、氟化鈉。

1.2儀器與試劑 MultiGene Gradient PCR 循環(huán)儀(美國(guó)Labnet)，HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司) UV-2450，SHIMADZU 紫外光度儀(日本島津公司)，Western印跡電泳槽、電源(美國(guó)Bio-Rad)。凱基全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20161013。一抗：OPG(H-249)：Santa Cruz Biotechnology，貨號(hào)：sc-11383；RANKL(C-20)：Santa Cruz Biotechnology，貨號(hào)：sc-7627；β-actin，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0061R。二抗：抗兔IgG，Cell Signaling Technology，#7074；HRP 兔抗山羊，武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BA1060。

1.3方法

1.3.1模型建立及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，分別為22只和82只。全部動(dòng)物按照300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉。用碘伏行皮膚消毒后，用手術(shù)剪刀沿后正中線切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約2 cm。于肋弓下脊柱旁開(kāi)1 cm處切開(kāi)肌肉，打開(kāi)后腹膜。找到位于腎臟后下方的脂肪團(tuán)，將卵巢輕柔提出，并分離周圍脂肪組織，結(jié)扎雙側(cè)卵巢下方的輸卵管、血管。切除雙側(cè)卵巢，放入固定液固定。然后逐層縫合，在每側(cè)手術(shù)部位注射青霉素1 ml。假手術(shù)組僅切除雙側(cè)卵巢旁部分脂肪，余處理同模型組。術(shù)后每天青霉素鈉鹽，連續(xù)3 d。術(shù)后70 d從兩組分別隨機(jī)選出10只大鼠處死后取右側(cè)股骨，去除附著肌肉和結(jié)締組織，采用雙能 X 射線骨密度(BMD)儀進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證造模是否成功。造模成功后，假手術(shù)組剩下 12 只，模型組大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、補(bǔ)腎基礎(chǔ)組、通絡(luò)組、補(bǔ)腎通絡(luò)組、阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組各12只。給予補(bǔ)腎通絡(luò)組6.3 g/kg、補(bǔ)腎基礎(chǔ)組5.4 g/kg、通絡(luò)組0.9 g/kg水提液灌胃〔8〕，阿侖膦酸鈉組1 mg/kg，氟化鈉組5 mg/kg藥物溶解液。1次/d，共70 d。

1.3.2取材及樣本處理 給藥結(jié)束后，動(dòng)物空腹12 h，采用7%水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉。待麻醉生效后，用5 ml一次性注射器從大鼠腹主動(dòng)脈抽取血液，轉(zhuǎn)入血液采集管，標(biāo)記及記錄。接著取出大鼠股骨，剔除軟組織及骨膜，用4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，用鋁箔紙包裹并標(biāo)記，放入-80℃中凍存。

1.3.3血清學(xué)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢查血清IL-1、IL-6、TNF-α。

1.3.4BMD檢測(cè) 采用雙能X線吸收法測(cè)定BMD。

1.3.5Western印跡法檢測(cè)骨組織RANKL/OPG蛋白的表達(dá) 用液氮將骨組織研磨至粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管，按0.2 g/ml的比例加入裂解液劇烈震蕩，以使組織充分裂解。3 000 r/min離心，取上清得到骨組織蛋白。通過(guò)氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測(cè)得其濃度。依據(jù)所得蛋白濃度調(diào)整煮樣的濃度，然后，12%分離膠中加入30 μg樣品。接著將分離的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；室溫封閉2 h；一抗4℃過(guò)夜，次日1×TBST洗3次，每次10 min；然后室溫孵育二抗2 h。最后，通過(guò)超敏發(fā)光液看到免疫反應(yīng)條帶并且通過(guò)Bio-Rad軟件定量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組IL-1、IL-6明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補(bǔ)腎通絡(luò)組及通絡(luò)組IL-1、IL-6均顯著減少(P<0.01),補(bǔ)腎基礎(chǔ)組無(wú)明顯變化(P>0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠TNF-α顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補(bǔ)腎通絡(luò)組及補(bǔ)腎基礎(chǔ)組TNF-α均明顯減少(P<0.05)，通絡(luò)組TNF-α顯著減少(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2各組BMD水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組BMD顯著減少(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和補(bǔ)腎通絡(luò)組BMD均顯著增加(P<0.01),氟化鈉組、通絡(luò)組及補(bǔ)腎基礎(chǔ)組BMD均明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3檢測(cè)各組RANKL/OPG蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組RANKL/OPG蛋白比值顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和補(bǔ)腎基礎(chǔ)組RANKL/OPG蛋白比值均明顯減少(P<0.05),氟化鈉組、補(bǔ)腎通絡(luò)組及通絡(luò)組RANKL/OPG蛋白比值均顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)表2，圖1。

表1 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

表2 各組RANKL/OPG蛋白表達(dá)水平比較

圖1 Western印跡檢測(cè)各組RANKL/OPG蛋白表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)自古就有“七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子”、“精傷則骨酸痿厥”、“腎虛則骨枯髓減”等論述，表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以“腎虛-本痿”為根本病機(jī)，屬“骨痿”范疇。臨床上從“骨痿”論治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，其療效確切。遵循“欲壯其骨，當(dāng)補(bǔ)其腎”治則，左歸丸、右歸丸、二至丸等補(bǔ)腎經(jīng)方及補(bǔ)腎為主的骨康膠囊、骨疏康顆粒、仙靈骨葆片等臨床驗(yàn)方〔9～15〕，均有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，骨質(zhì)疏松模型組大鼠實(shí)驗(yàn)前后骨密度顯著減少。與之前研究一致，阿侖膦酸鈉能夠顯著增加骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度。本文發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥組、通絡(luò)藥組及補(bǔ)腎通絡(luò)方組骨密度均明顯增加,尤其要指出的是，補(bǔ)腎通絡(luò)方組骨密度增加優(yōu)于補(bǔ)腎中藥組以及通絡(luò)藥組，這些研究提示補(bǔ)腎通絡(luò)方及方中兩藥協(xié)同增加骨密度，具有治療骨質(zhì)疏松效果。

全蝎、蜈蚣等蟲(chóng)類藥是最具代表性的通絡(luò)中藥，善于“搜剔絡(luò)中混處之邪”，對(duì)骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等骨性頑痹療效顯著〔16〕。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有關(guān)于全蝎、水蛭、僵蠶等蟲(chóng)類藥記載。張仲景認(rèn)為蟲(chóng)類藥對(duì)深伏經(jīng)絡(luò)之邪具有草木之藥不可比擬的治療優(yōu)勢(shì)，并首創(chuàng)蟲(chóng)類搜剔通絡(luò)法?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，全蝎、蜈蚣等蟲(chóng)類藥透骨搜邪和通絡(luò)止痛功效是通過(guò)抑制TNF-α、 IL-1、IL-6等致炎因子實(shí)現(xiàn)，而這些致炎因子廣泛作用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨形成/骨吸收病理過(guò)程〔17～19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥組、通絡(luò)中藥組及補(bǔ)腎通絡(luò)方組均能夠降低骨質(zhì)疏松模型大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α顯著降低，提示補(bǔ)腎通絡(luò)方及方中兩藥能夠抑制炎性因子表達(dá)，尤其是通絡(luò)藥抑炎效果顯著，從而導(dǎo)致骨吸收過(guò)程明顯減少，提高骨密度。

OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路是調(diào)節(jié)骨重建過(guò)程中破骨細(xì)胞功能的重要通路。成骨細(xì)胞釋放的RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后通過(guò)NF-Kb途徑、JNK途徑、蛋白激酶B途徑等促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和激活;OPG則可競(jìng)爭(zhēng)性抑制RANK與RANKL的結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞功能,減少骨吸收〔20〕。因此，RANKL/OPG蛋白比值與骨量及骨密度呈負(fù)相關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、補(bǔ)腎中藥組、通絡(luò)中藥組及補(bǔ)腎通絡(luò)方組RANKL/OPG蛋白比值均顯著下降。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)可以降低RANKL/OPG蛋白比值，抑制破骨細(xì)胞增殖活化，減少骨吸收〔9,21〕。此外，通絡(luò)中藥組及補(bǔ)腎通絡(luò)方組RANKL/OPG均顯著減少，提示通絡(luò)中藥及補(bǔ)腎通絡(luò)方中兩藥能夠協(xié)同降低RANKL/OPG蛋白比例，抑制破骨細(xì)胞增殖活化，減少骨吸收，增加骨密度，逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥。因此，通絡(luò)法及蟲(chóng)類通絡(luò)中藥是“補(bǔ)腎”治療的必要補(bǔ)充。