袁吉祥 姚成立 李繼東

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750002)

流行病學(xué)研究已經(jīng)確立高同型半胱氨酸血癥(HH)是動(dòng)脈粥樣硬化性和血栓性心腦血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素〔1〕。隨機(jī)臨床試驗(yàn)顯示口服補(bǔ)充葉酸、維生素B6、B12可以雖然可以顯著降低HH，但是似乎并沒有改善心腦血管疾病的二級預(yù)防結(jié)局〔2〕。內(nèi)源性抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)成為目前防治HH所致動(dòng)脈粥樣硬化研究的熱點(diǎn)〔3〕。本研究利用3個(gè)危險(xiǎn)因素造成動(dòng)脈粥樣硬化，分別是：動(dòng)脈內(nèi)膜機(jī)械損傷、高脂血癥及HH。同時(shí)利用葉酸和GSH進(jìn)行干預(yù)，觀察藥物對血脂、同型半胱氨酸(HCY)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化程度的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 健康雄性新西蘭大耳白兔40只，體重2.0～2.5 kg，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。L-蛋氨酸，膽固醇，GSH由Sigma公司提供。

1.2血管損傷模型的建立 分離右側(cè)股動(dòng)脈，直視下穿刺并置入5F鞘管，經(jīng)導(dǎo)絲引入后擴(kuò)張球囊(3.5 mm×15 mm)，以12 atm的壓力擴(kuò)張并拉傷腹主動(dòng)脈建立血管損傷模型〔4〕。

1.3動(dòng)物分組與給藥方法 健康雄性新西蘭大耳白兔40只隨機(jī)分為4組：對照組，模型組，葉酸組，GSH組。所有兔子先行腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，術(shù)后對照組給予家兔顆粒飼料喂養(yǎng)12 w，模型組，葉酸組，GSH組術(shù)后給予5%脂肪+2%蛋氨酸顆粒飼料喂養(yǎng)12 w。葉酸組給予葉酸顆粒5 mg每日3次口服干預(yù)。GSH組給予GSH顆粒 0.2 g每日3次口服干預(yù)。

1.4血清檢測 術(shù)后2 w、12 w自兔子心臟采血，利用全自動(dòng)生化儀檢測血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及HCY水平，采用Fenton比色法測定血清中活性氧(ROS)水平。黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平(試劑盒購于南京建成生物工程研究所) 。

1.5病理學(xué)檢查 術(shù)后12 w用注射空氣法處死兔子，開腹暴露腹主動(dòng)脈，剝離損傷的血管段，生理鹽水沖洗后,截取2 cm損傷血管固定于10%甲醛溶液中行血管內(nèi)膜油紅O染色。截取2 cm損傷血管放入1.5 ml離心管里，-20℃冷藏，1 w內(nèi)行冰凍切片油紅O染色。截取2 cm固定于10%甲醛溶液，24 h后常規(guī)石蠟包埋，間隔相同距離于血管段25%、50%、75%分位切片3次(切片厚度4 μm)，行HE染色、核因子(NF)-κB免疫組化染色后光鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1術(shù)后2 w和12 w時(shí)各組血清HCY水平 術(shù)后2 w后，模型組、葉酸組及GSH組HCY水平較對照組明顯升高(P<0.05)，術(shù)后12 w后，模型組、葉酸組及GSH組HCY顯著升高(P<0.05)，對照組無明顯變化(P>0.05)。但是葉酸組、GSH組與模型組比較HCY水平均相對較低(P<0.05)，葉酸組與GSH組比較HCY相對較低，但無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 2 w和12 w時(shí)血清HCY水平

與對照組比較：1)P<0.05；與本組2 w比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05，下表同

2.2術(shù)后12 w時(shí)各組血脂水平 喂養(yǎng)12 w后，模型組、葉酸組及GSH組血脂水平較對照組顯著升高(P<0.05)。葉酸組與模型組比較血脂水平無明顯差異(P>0.05)，GSH組與模型組比較TG,TG,LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高(P<0.05)，見表2。

2.3術(shù)后12 w兔子氧化應(yīng)激水平 術(shù)后12 w模型組、葉酸組及GSH組氧化應(yīng)激水平較對照組顯著升高(P<0.05)。葉酸組與模型組比較ROS、SOD、ox-LDL水平無顯著差異(P>0.05)，GSH組與模型組比較ROS、ox-LDL水平明顯降低(P<0.05)，SOD水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 12 w時(shí)各組血清ROS,SOD,ox-LDL水平

2.4兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣硬化斑塊形成情況 對照組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜輕度增生；模型組兔子主動(dòng)脈新生內(nèi)膜顯著增厚，結(jié)構(gòu)疏松，可見脂肪沉積形成的空泡；葉酸組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜顯著增厚，可見脂肪裂隙；GSH組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚。見圖1。對照組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜表面增生硬化，油紅O不著色；模型組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜可見彌漫性、融合成片的鮮紅色脂質(zhì)斑塊隆起凸出于表面；葉酸組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜亦可見成片的脂質(zhì)斑塊；GSH組兔子主動(dòng)脈內(nèi)膜表面硬化不平，可見隆起于表面的條紋狀紅色斑塊。葉酸組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)，見表4。葉酸組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜厚度百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)，見表4。對照組兔腹主動(dòng)脈橫切面細(xì)胞增生，全層無油紅O著色；模型組兔腹主動(dòng)脈管壁增厚，管壁結(jié)構(gòu)疏松，各層都有鮮紅色米粥樣脂滴浸潤；葉酸組兔腹主動(dòng)脈管壁增厚，結(jié)構(gòu)疏松，各層都有脂滴浸潤。GSH組兔子腹主動(dòng)脈管壁增厚，可見泡沫細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)小密集的紅色脂肪顆粒。見圖2。葉酸組兔腹主動(dòng)脈橫切面脂質(zhì)斑塊百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)。見表4。對照組新生內(nèi)膜NF-κB少量表達(dá)；模型組新生內(nèi)膜NF-κB大量表達(dá)；葉酸組新生內(nèi)膜NF-κB中量表達(dá)；GSH組新生內(nèi)膜NF-κB表達(dá)減少。見圖3。NF-κB主要在新生內(nèi)膜中表達(dá)。葉酸組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜NF-κB陽性細(xì)胞百分比與模型組比較未見明顯減少(P>0.05)，GSH組與模型組比較顯著減少(P<0.05)。見表4。

圖1 各組兔腹主動(dòng)脈新生內(nèi)膜厚度(HE,×100)

圖2 各組兔腹主動(dòng)脈橫切面粥樣硬化斑塊形成情況(油紅O染色，×200)

圖3 各組兔腹主動(dòng)脈NF-κB表達(dá)(DAB，×200)

表4 各組腹主動(dòng)脈病理結(jié)果分析

3 討 論

HCY為一種含硫氨基酸，為體內(nèi)蛋氨酸代謝的一個(gè)重要中間代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)的HCY主要由飲食攝取的蛋氨酸在肝臟、肌肉及其他一些組織中脫甲基生成。蛋氨酸在ATP酶作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷蛋氨酸，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷同型半胱氨酸，進(jìn)一步去腺苷后生成HCY〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)2%蛋氨酸喂養(yǎng)模型組兔子2 w，HCY已經(jīng)明顯升高至對照組水平的5倍，喂養(yǎng)至12 w，模型組兔子HCY上升至對照組水平的8倍。HCY在體內(nèi)的代謝通路包括〔6〕：①重甲基化途徑：在二甲基四氫葉酸還原酶催化下，以維生素B12作為輔基，重新甲基化生成蛋氨酸(甲硫氨酸)。②甲基化的替代途徑：由甜菜堿提供甲基，在甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)催化下，生成蛋氨酸及二甲基甘氨酸，在肝臟完成。③ 轉(zhuǎn)硫途徑：HCY經(jīng)轉(zhuǎn)硫途徑不可逆生成胱氨酸和α-酮丁酸、硫酸和水，此過程需維生素B6依賴的胱硫醚β合成酶參與。④HCY在重金屬離子(Fe3+或Ca2+)存在下，自身氧化。⑤釋放到細(xì)胞外液。本研究結(jié)果表明，口服葉酸可以促進(jìn)HCY代謝，降低血液中HCY水平，但未明顯影響血脂水平。GSH是人類細(xì)胞質(zhì)中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基(-SH)，廣泛分布于機(jī)體各器官內(nèi)。外源性補(bǔ)充GSH不但可以降低HH，還能降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C的水平。GSH降低HH的機(jī)制可能是通過GSH的轉(zhuǎn)甲基作用促進(jìn)蛋氨酸循環(huán)。GSH調(diào)脂作用機(jī)制可能是通過轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)丙氨基反應(yīng)，促進(jìn)肝臟合成HDL，運(yùn)載周圍組織中的膽固醇，再轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體或者細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，或外源性氧化物質(zhì)的過量攝入，導(dǎo)致ROS在機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的細(xì)胞毒性過程〔7〕。ROS在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著十分重要的角色。在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化磷酸化過程中，氧分子通過單電子接受反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子自由基(O2ˉ·)、過氧化氫(H2O2)及羥基自由基(·OH)等中間產(chǎn)物，并最終轉(zhuǎn)化為水。這些中間產(chǎn)物由氧分子轉(zhuǎn)化而來，具有比氧分子更活潑的化學(xué)反應(yīng)性，統(tǒng)稱為ROS〔8〕。ROS在SOD的催化作用下能夠產(chǎn)生歧化反應(yīng)，從而被清除，以保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基的攻擊和損害。SOD是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種金屬抗氧化酶類〔9〕，廣泛存在于動(dòng)物血液和植物種子中。本研究表明，5%脂肪+2%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)12 w后，模型組兔子ROS顯著升高，SOD也相應(yīng)升高。葉酸未能明顯影響ROS和SOD的水平。GSH顯著降低了ROS水平，升高了SOD水平，使血液中ROS的產(chǎn)生與清除趨向平衡。

本研究表明，HH、高脂血癥和動(dòng)脈內(nèi)膜的機(jī)械損傷共同作用可以導(dǎo)致明顯的動(dòng)脈粥樣硬化。其可能的機(jī)制包括〔10〕：①HH通過自身氧化、HCY二硫化物的形成、Hcy硫內(nèi)酯的形成及蛋白質(zhì)的Hcy化生成H2O2和氧自由基，對內(nèi)皮細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性作用。②HH、高脂血癥和動(dòng)脈內(nèi)膜的機(jī)械損傷可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移。③HH和高脂血癥促進(jìn)LDL-C氧化為ox-LDL，后者被巨噬細(xì)胞吞噬后成為泡沫細(xì)胞，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化過程。④氧自由基攻擊生物膜中的多鏈不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用。本研究結(jié)果表明，術(shù)后12 w，模型組兔子ox-LDL水平顯著升高，葉酸未能明顯影響ox-LDL水平，而GSH明顯降低了ox-LDL水平。GSH可能是通過巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸類物質(zhì)從而加速自由基的排泄，降低了LDL-C的氧化反應(yīng)及膜脂質(zhì)過氧化作用。

NF-κB是一類特殊的蛋白質(zhì)，具有和基因啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能，參與調(diào)控許多與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化中起重要作用〔11〕。NF-κB的異常激活是體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)放大和持續(xù)的分子生物學(xué)機(jī)制，是HH致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)機(jī)制之一〔12〕。HH誘導(dǎo)超氧陰離子的產(chǎn)生增加，對動(dòng)脈粥樣硬化早期NF-κB的激活起一定作用〔13〕。本研究中NF-κB主要在新生內(nèi)膜中表達(dá)，提示動(dòng)脈粥樣硬化主要發(fā)生在新生內(nèi)膜。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明葉酸未能明顯影響NF-κB的活性，GSH可以明顯抑制NF-κB的活性，提示GSH可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的活性來影響動(dòng)脈粥樣硬化。

總之，GSH可以通過降低血清HCY、調(diào)節(jié)血脂水平、抗氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)NF-κB的活性等途徑抑制動(dòng)脈粥樣硬化，可以推測聯(lián)合葉酸、維生素B6、B12及還原型谷胱甘肽來防治HH所致動(dòng)脈粥樣硬化會有良好的應(yīng)用前景。