宋正海

(江蘇省盱眙中學(xué) 淮安 211700)

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板又稱血球計(jì)數(shù)器，是高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的細(xì)胞計(jì)數(shù)工具。本文對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)、計(jì)數(shù)原理等問題進(jìn)行詳細(xì)的解讀。

1 解讀血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的相關(guān)信息

1.1 目視信息及分析 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，有4個(gè)凹槽[1]，中間部分被一“H”型凹槽分成上、下兩個(gè)相同的計(jì)數(shù)平臺(tái)，每個(gè)平臺(tái)中有長、寬各3mm的計(jì)數(shù)區(qū)域，平均分為9個(gè)大方格。計(jì)數(shù)室(指中央的一個(gè)大方格，下同)的長和寬各是1mm，計(jì)數(shù)板上標(biāo)識(shí)的“0.1mm”是指計(jì)數(shù)室的高度(圖1)。所以，計(jì)數(shù)室體積為1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mL。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板有兩種規(guī)格，一種是25×16型(湯麥?zhǔn)?，?biāo)識(shí)為XB-K-25)，另一種是16×25(希利格式)。湯麥?zhǔn)窖?xì)胞計(jì)數(shù)板的每個(gè)計(jì)數(shù)室有25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格；而希利格式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板每個(gè)計(jì)數(shù)室中有16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分25個(gè)小方格。

所以，上述兩種規(guī)格的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室都有400個(gè)小方格，即體積為0.1mm3的計(jì)數(shù)室被平分為400個(gè)小格。

圖1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 顯微觀察信息及分析 在顯微鏡下，可以觀察到計(jì)數(shù)室及其周圍被許多線條規(guī)則地分隔成許多小室(圖2)。計(jì)數(shù)板上的線條分為單線和雙線兩種，雙線區(qū)分不同中方格，每一中方格四周的線都是雙線，計(jì)數(shù)室與周圍區(qū)域的區(qū)分線也是雙線；單線用于區(qū)分小方格[2]。計(jì)數(shù)室內(nèi)的單線和雙線向外延伸，因此計(jì)數(shù)室外的線也可分為單線和雙線兩種。計(jì)數(shù)室周圍的線并非只是起引導(dǎo)作用，與計(jì)數(shù)室四個(gè)頂點(diǎn)相鄰的四個(gè)大方格，其內(nèi)只有中方格而無小方格，這四個(gè)區(qū)域可用于體積較大的單細(xì)胞計(jì)數(shù)(如白細(xì)胞等)。

圖2 計(jì)數(shù)室示意圖

2 細(xì)胞計(jì)數(shù)原理

由于計(jì)數(shù)室內(nèi)有400個(gè)小方格，如果對(duì)所有小方格進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，因視野所限，不易操作，容易造成較大誤差，所以一般采用定點(diǎn)取樣計(jì)數(shù)。不同規(guī)格的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板取樣點(diǎn)不同，湯麥?zhǔn)窖?xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室中有25個(gè)中方格，則取計(jì)數(shù)室4個(gè)角和中央的共5個(gè)中方格進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)；而希利格式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室中有16個(gè)中方格，則取計(jì)數(shù)室4個(gè)角的中方格進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。對(duì)于壓在方格界限上的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細(xì)胞數(shù)，再加上中方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，作為該中方格的細(xì)胞總數(shù)。如果一個(gè)方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)過多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)再對(duì)樣液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，一般以每個(gè)小方格內(nèi)分布4～5個(gè)細(xì)胞為宜。如果統(tǒng)計(jì)的每個(gè)中方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目相互之間相差20個(gè)以上，表示細(xì)胞分布不均，必須對(duì)樣液搖勻后重新計(jì)數(shù)。

3 計(jì)算細(xì)胞密度的方法

對(duì)5(或4)個(gè)中方格計(jì)數(shù)完畢后，可通過下列兩種方法計(jì)算樣液中細(xì)胞密度： ①細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL=5(或4)個(gè)中方格中細(xì)胞總數(shù)÷5(或4)×25(或16)×稀釋倍數(shù)×104；②細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL=(80個(gè)小格中細(xì)胞數(shù))÷80×400×稀釋倍數(shù)×104。其中“×104”表示將0.1mm3(計(jì)數(shù)室體積)轉(zhuǎn)換成1mL溶液中細(xì)胞密度。

4 細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)及思考

如果計(jì)數(shù)室中細(xì)胞充分分散(圖3a)，則逐個(gè)計(jì)數(shù)；如果出現(xiàn)細(xì)胞成簇分布，能夠清晰分辨細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的分別計(jì)數(shù)為單個(gè)細(xì)胞(圖3b)；如果不能清晰分辨細(xì)胞核，則計(jì)為1個(gè)細(xì)胞(圖3c)。如果在實(shí)驗(yàn)中多處出現(xiàn)圖3c的現(xiàn)象，最可能的原因?yàn)闃右何闯浞謸u勻或稀釋倍數(shù)不夠所致，需重新實(shí)驗(yàn)；如果只是一處或幾處出現(xiàn)此現(xiàn)象，可按以上計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖3 細(xì)胞分散情況

在細(xì)胞計(jì)數(shù)中，為較快而準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)，一般選擇“S”型計(jì)數(shù)路徑進(jìn)行計(jì)數(shù)： 第一排，從左向右；第二排，從右向左；第三排，從左向右；第四排，從右向左(圖4)[3]。在2018年江蘇省生物學(xué)科學(xué)業(yè)水平測試卷中，第40題第(2)小題即考查了對(duì)一個(gè)視野中酵母細(xì)胞最佳計(jì)數(shù)路徑的選擇。雖然此問題在教材中并未直接涉及，但卻是學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作中不可回避的問題，該試題通過對(duì)學(xué)生科學(xué)思維的考查，充分體現(xiàn)了生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的要求，也再次提醒教學(xué)中要用教材教，而非教教材。

圖4 細(xì)胞計(jì)數(shù)路徑示意圖