高 梅，彭 喆，吳曉燕，時建立,，辛長勛，鄭書軒，劉玉偉，王 碩，王金寶,*，李 俊,*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要致病性病原，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥，其臨床主要表現(xiàn)為仔豬斷奶后生長遲緩、體重減輕、皮膚蒼白、呼吸衰竭、呼吸痛苦、被毛蓬亂等，該病不但可以引起斷奶仔豬淋巴衰竭、腹瀉、淋巴組織肉芽腫性炎癥、死亡，還能引起仔豬先天性腦震顫、母豬繁殖障礙等，并可能與豬皮炎腎炎綜合征、呼吸道疾病綜合征等疾病密切相關(guān)[1-4]。更為嚴(yán)重的是，感染PCV2所引起的豬免疫抑制會導(dǎo)致豬其它疾病免疫的失敗，并引起其它病原的繼發(fā)性感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。

豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為迄今已知最小的動物病毒之一，直徑17 nm，無囊膜，基因全長為1 767 bp或1 768 bp，共有11個開放閱讀框，其中以O(shè)RF1和ORF2最為重要。ORF1閱讀框編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，編碼314個氨基酸，該蛋白氨基酸序列相對保守，Rep mRNA是病毒基因組的初始轉(zhuǎn)錄物，與病毒的復(fù)制密切相關(guān)；ORF2編碼233個氨基酸，為病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼(Cap)，也是主要的免疫原性蛋白[5-8]。目前，基于Cap蛋白，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)建立了一系列的研究及檢測方法，而對Rep蛋白的研究報道較少，本研究以本實驗室克隆構(gòu)建的重組質(zhì)粒PQE30-PCV2 Rep進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，純化后的蛋白作為免疫原免疫小鼠，利用細(xì)胞雜交瘤篩選技術(shù)制備了針對PCV2 Rep蛋白的特異性單克隆抗體，為PCV2的進(jìn)一步研究和診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和動物 PQE30-PCV2 Rep原核表達(dá)載體、大腸桿菌M15，由山東省畜禽疾病防治與繁育重點實驗室保存；SPF級BALB/c小鼠，雌性，8～10周齡，購自山東大學(xué)試驗動物中心。

1.1.2 試劑耗材 IPTG、Acr、Bis、Tris、PEG、SDS、TEMED，Sigma公司；Protein Marker，Thermo公司；Yeast Extract，oxoid公司；0.22 μm無菌濾器，Millipore公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；Ni2+IDA親和層析膠，Novagen公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒 Proteintech，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗儀器 HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；3111-水套式CO2培養(yǎng)箱，Thermo scientific公司；蛋白電泳儀，BIORAD公司； Gel Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)，BIORAD公司；Spectra Max I3多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司；AUW120D電子天平，日本島津有限公司；NanoDrop 2000，Thermo公司。

1.2 方 法

1.2.1 IPTG誘導(dǎo)PQE30-PCV2 Rep融合蛋白的表達(dá)與純化 將測序正確的原核表達(dá)重組質(zhì)粒PQE30-PCV2 Rep轉(zhuǎn)化M15感受態(tài)細(xì)胞[9-10]，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落接種于卡那霉素濃度為50 μg/L的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)過夜，次日按1:100接種于氨芐青霉素濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 200 r/min振搖至菌體OD600為0.8～1.0；取出1mL培養(yǎng)物，10 000 g室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，振蕩培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 g室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。剩余培養(yǎng)物離心后棄上清，PBS重懸菌體沉淀進(jìn)行超聲波破碎，分別取上清液與沉淀液進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

1.2.2 包涵體蛋白的變復(fù)性與純化 將菌體沉淀重懸于Lysis buffer超聲破碎，破碎后的細(xì)胞裂解液4 ℃離心收集沉淀；對包涵體進(jìn)行洗滌液洗滌3次、變性劑溶解、透析袋透析復(fù)性過夜。最后Ni柱親和純化，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.2.3 單克隆抗體的制備

1.2.3.1 小鼠免疫 選取5只雌性BALB/c小鼠，將PQE30-PCV2 Rep蛋白與弗氏佐劑混合免疫，皮下注射100 μg/只，2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次，采血進(jìn)行間接ELISA檢測，以確定抗血清針對PQE30-PCV2 Rep蛋白的效價，待效價>1:10000時進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.3.2 細(xì)胞融合 四次免疫后血清ELISA效價在1:10000以上的小鼠，在融合前3 d終免，腹腔注射抗原100 μg。融合當(dāng)天無菌取脾臟研磨，收集脾細(xì)胞，按骨髓瘤細(xì)胞:脾細(xì)胞=1:20比例混合骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞。將混合后細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋后1 000 r/min 5 min離心后棄上清，緩慢加入50%聚乙二醇，反應(yīng)90 S后再加入DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)，融合的細(xì)胞置37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min。1 000 r/min 5 min離心棄上清，加入HAT DMEM培養(yǎng)基混懸，混懸后的細(xì)胞按100 mL/孔加到96孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合約10 d后開始進(jìn)行篩選檢測[11-13]。

1.2.3.3 融合檢測及亞克隆 檢測的前一天，用PBS包被5 μg/mL抗原于ELISA板過夜。檢測時吸取細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，100 μL/孔。根據(jù)ELISA結(jié)果，樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1判定為陽性孔。將檢測出的陽性孔進(jìn)行第二次ELISA檢測重復(fù)確認(rèn)，確認(rèn)后的陽性孔細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，至檢測100%陽性后，挑出單克隆孔擴(kuò)大培養(yǎng)定株。

1.2.4 單克隆抗體小鼠腹水制備及抗體亞型鑒定BALB/c小鼠腹腔中注射礦物油，0.5 mL/只，7 d后腹腔注射用陽性克隆雜交瘤細(xì)胞(1×106細(xì)胞/只)，誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水。注射免疫8～12 d后，收集腹水，按小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行鑒定，用間接ELISA方法對1G4，2G4，6H12細(xì)胞株誘生的小鼠腹水單抗進(jìn)行分析。

1.2.5 小鼠腹水單克隆抗體效價、純度測定 取6H12腹水進(jìn)行Protein A純化，得到所需純化抗體后立即置PBS中4 ℃透析過夜，次日進(jìn)行濃度、純度、效價等檢測。采用間接ELISA法測量小鼠腹水的抗體效價，用PBS包被液將PQE30-PCV2 Rep蛋白按5 μg/mL濃度加入板條中置4 ℃冰箱過夜，100 μL/孔。次日棄去包被液，洗板2～3次，按200 μL/孔加入封閉液，置37℃恒溫箱1 h后棄去內(nèi)液，洗板1次。純化抗體按起始稀釋度為1∶500，100 μL/孔37 ℃恒溫箱放置1 h進(jìn)行一抗反應(yīng)。一抗反應(yīng)結(jié)束后，將酶標(biāo)板中內(nèi)液棄去，洗滌3次，每孔中再加入100 μL 1/5 000山羊抗小鼠-HRP酶標(biāo)二抗，37 ℃恒溫箱反應(yīng)1 h。二抗反應(yīng)結(jié)束后取出酶標(biāo)板，洗滌4次，加入TMB顯色液，100 μL /孔，37 ℃ 15 min顯色，再每孔加入100 mL1 mol/L HCL溶液，終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度，將樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1的孔對應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價。純化后抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，進(jìn)行純度檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化分析

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化M15后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集處理樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后的樣品在分子量40 kDa附近出現(xiàn)明顯條帶，其大小與預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物分子量相符，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的樣品則無明顯條帶(圖1)，證明重組質(zhì)粒PQE30-PCV2 Rep在大腸桿菌M15中成功表達(dá)。

對菌體裂解液的上清和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示PQE30-PCV2 Rep蛋白出現(xiàn)在沉淀中，主要以包涵體的形式表達(dá)，故對目的蛋白進(jìn)行復(fù)性純化，以獲得目標(biāo)蛋白。12% SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示在約分子量40kDa處有明顯條帶(圖2)，表明重組PQE30-PCV2 Rep蛋白純化成功。

2.2 4免后小鼠血清效價ELISA結(jié)果

4次免疫后，取小鼠血清用間接ELISA 方法進(jìn)行抗體效價測定，結(jié)果顯示，2#、3# 小鼠的血清抗體效價較高，其中以2#小鼠效價最高，滿足細(xì)胞融合的要求。

圖1 PQE30-PCV2 Rep表達(dá)圖 M.蛋白Marker;1.誘導(dǎo)前；2.誘導(dǎo)后；3.超聲破碎后上清；4.超聲破碎后沉淀Fig.1 Expression diagram of PQE30-PCV2 Rep M.Protein marker;1.before induction; 2.after induction;3.induced supematant after sonication; 4.induced prcipitate after sonication

圖2 PQE30-PCV2 Rep純化圖 M.蛋白Marker;1.樣品；2.經(jīng)柱流出3.洗脫Fig.2 Purification diagram of PQE30-PCV2 Rep M.Protein marker;1.sample; 2.out of the column;3.elution

序號Number稀釋度DilutionOD值 OD value(A450 nm)1#鼠 1# mice2#鼠 1# mice3#鼠 1# mice4#鼠 1# mice5#鼠 1# mice15002.9753.1353.0073.0412.83921,5002.8853.1863.0072.8902.77534,5002.3572.9132.7982.3572.370413,5001.3622.2242.0831.5151.460540,5000.7021.1981.1420.7810.7076121,5000.6031.0881.0430.6050.5627Blank0.062

2.3 單克隆抗體制備與生物學(xué)特性

2.3.1 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 選取效價較高的2#小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后第7天觀察融合率為80%以上。ELISA檢測進(jìn)行篩選獲得3株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1G4，2G4，6H12，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，置液氮凍存。經(jīng)復(fù)蘇后測定細(xì)胞仍保持分泌抗PQE30-PCV2 Rep蛋白的能力，擴(kuò)大培養(yǎng)后腹腔接種于BALB/c小鼠，接種后約10 d小鼠產(chǎn)生腹水并收集。

2.3.2 單克隆抗體的亞類鑒定 用間接ELISA方法對1G4，2G4，6H12細(xì)胞株誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腹水單抗進(jìn)行分析，結(jié)果表明腹水1G4屬于IgG2a型；腹水2G4和6H12屬于IgG2b型。選取OD值最高的細(xì)胞株6H12進(jìn)行深入研究。

2.3.3 小鼠腹水單克隆抗體效價測定 通過抗體ELISA效價結(jié)果得出，6H12抗體ELISA效價在256K左右。

表2 定株后細(xì)胞上清ELISA結(jié)果Table 2 ELISA results of cell supernatant

表3 6H12抗體間接ELISA 結(jié)果Table 3 Indirect ELISA results of 6H12 antibody

2.3.4 抗體濃度測定 純化后6H12抗體用紫外分光光度計檢測，抗體濃度為0.47 mg/mL。

2.3.5 抗體純度鑒定 純化后6H12抗體進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示抗體純化后純度在90%以上。

圖3 6H12抗體純度鑒定圖Fig.3 Purity idenfificafion diagram of 6H12 antibody

3 討 論

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，根據(jù)抗原性和致病性的不同，分為圓環(huán)病毒1型(PCV1) 和圓環(huán)病毒2型(PCV2)，圓環(huán)病毒1型對豬沒有致病性，圓環(huán)病毒2型對豬有致病性，是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)等疾病的病原。PCV2不僅可以引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥，而且與豬皮炎與腎病綜合征、母豬繁殖障礙、壞死性肺炎、腸炎、豬繁殖與呼吸障礙綜合征等疾病亦有重要關(guān)聯(lián)[14-16]。由閱讀框ORF2編碼的Cap蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒和宿主細(xì)胞結(jié)合及與機(jī)體的免疫應(yīng)答保護(hù)反應(yīng)密切相關(guān)，在PCV1和PCV2之間較大，因此對PCV2的Cap蛋白編碼基因的研究是當(dāng)前熱點，國內(nèi)外學(xué)者業(yè)已建立了一系列基于Cap蛋白的研究及檢測方法[17-19]，而相對Rep蛋白的研究則較少[20-22]。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)對Rep蛋白進(jìn)行表達(dá)，用純化后的蛋白作為抗原免疫小鼠后細(xì)胞進(jìn)行融合，常規(guī)雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞系，采用間接ELISA篩選獲得3株特異性分泌抗ORF1蛋白的雜交瘤細(xì)胞系，并進(jìn)行了連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存，用間接ELISA方法對1G4，2G4，6H12細(xì)胞株誘導(dǎo)的小鼠腹水單抗進(jìn)行分析，亞型鑒定結(jié)果表明,腹水1G4屬于IgG2a型；腹水2G4和6H12屬于IgG2b型。然后我們選取了6H12株單克隆抗體進(jìn)行后續(xù)研究，結(jié)果顯示6H12單抗效價在256K左右，濃度為0.47 mg/mL，抗體純化后純度在90%以上。本試驗采用常規(guī)免疫的方法免疫制備單抗，取得了較好的免疫效果，試驗從雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)、液氮凍存經(jīng)復(fù)蘇后分泌抗體的能力、以及單克隆抗體的亞類、濃度、純度、效價等多方面，考察了3株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力和所制備的單克隆抗體的特性。因此，本研究成功制備了3種單克隆抗體，在后續(xù)工作中，可繼續(xù)研究這3種單抗用于Rep蛋白的定量檢測、膠體金試紙條的制備、ELISA診斷試劑盒的研發(fā)等，同時也為豬圓環(huán)病毒2型的檢測、診斷與預(yù)防提供了新方法。