高 云 謝小兵

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)的以持續(xù)性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病之一，具有較高的致殘率和致死率。隨著環(huán)境污染日益加重，人口老齡化的加速和吸煙人數(shù)的增多，COPD的發(fā)病率和病死率正逐年增高。目前認(rèn)為COPD的發(fā)生發(fā)展可能與環(huán)境因素、遺傳因素和個(gè)體易感因素相關(guān)，且發(fā)病機(jī)制在不同的基因和不同的環(huán)境因素及不同種族人群的COPD患者中不同[1-2]，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)COPD具有家族聚集傾向和種族地域差異性[3]。有關(guān)其發(fā)病的確切機(jī)制目前尚未完全明了，公認(rèn)的機(jī)制包括炎癥反應(yīng)機(jī)制、氧化/抗氧化失衡，蛋白酶/抗蛋白酶失衡機(jī)制等，其中炎癥過(guò)程是目前公認(rèn)的主要致病機(jī)制[4]。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)在COPD患者的痰液及血液中均能檢測(cè)出其水平增高[5]，是導(dǎo)致COPD、肺實(shí)質(zhì)受損及慢性炎癥損傷的細(xì)胞因子在COPD的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[6]。TNF-α的基因序列分析顯示，在啟動(dòng)子-308位點(diǎn)存在多態(tài)性，該位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)TNF基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有一定的影響[7]。目前對(duì)COPD與TNF-α-308基因多態(tài)性的相關(guān)性研究結(jié)論不一，有研究發(fā)現(xiàn)[8-9],TNF-α-308與亞洲患COPD的人群存在相關(guān)性，但與高加索地區(qū)患COPD的人群無(wú)相關(guān)性。這些研究提示COPD的易感性與TNF-α-308基因的多態(tài)性在不同人群中的作用機(jī)制可能不同。因此，本研究通過(guò)分析新疆維吾爾族、哈薩克族COPD組與對(duì)照組TNF-α-308位點(diǎn)基因型的分布特點(diǎn)，來(lái)探討該基因的多態(tài)性與新疆維吾爾族、哈薩克族人群COPD易感性的關(guān)系。

資料與方法

1.研究對(duì)象 選擇2014年1月至2016年1月,在我院老年醫(yī)學(xué)中心一病區(qū)住院治療的維吾爾族及哈薩克族COPD患者各80例為病例組，診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》的標(biāo)準(zhǔn)[10]，同時(shí)選擇于我院體檢的維吾爾族及哈薩克族健康體檢者各80例為對(duì)照組,其中維吾爾族健康對(duì)照組中男性48例；女性32例，哈薩克族男性51例，女性29例；平均年齡分別為(55.2±6.7)歲、(54.3±8.1)歲。病例組：維吾爾族COPD患者平均年齡(52.3±6.4)歲；男性43例，女性37例；哈薩克族COPD患者平均年齡(53.7±5.8)歲；男性39例，女性41例。以上四組在年齡、性別，BMI及吸煙指數(shù)等一般資料的比較,均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，且入選對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的人群。所有入選患者及健康志愿者均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

(1)納入標(biāo)準(zhǔn) 病例組：診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)2013年制定的《慢性阻塞性肺病診治指南》修訂版[10]中COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：即規(guī)定吸入支氣管擴(kuò)張劑后第一秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，且FEV1小于預(yù)計(jì)值的80%，F(xiàn)EV1預(yù)計(jì)值增加≤12%，同時(shí)伴有COPD的臨床癥狀如氣促、氣喘、慢性氣道阻塞。對(duì)照組：均符合以下條件：胸X線片或胸部CT正常；且肺功能符合以下指標(biāo)：FEV1/FVC>70%，且FEV1大于預(yù)計(jì)值的80%。病例組及對(duì)照組各研究對(duì)象均為長(zhǎng)期居住在新疆地區(qū)且無(wú)血緣關(guān)系及無(wú)無(wú)異族通婚史的人群。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有嚴(yán)重支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張疾病及其他部位感染等全身炎癥反應(yīng)性疾??；②合并有嚴(yán)重的糖尿病、心、肝、腎、血管疾??；③合并有肺間質(zhì)纖維化、肺結(jié)核、肺癌等其他影響肺功能的疾??；④腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及自身免疫性疾病；⑤精神病患者；⑥近期使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、非甾體類(lèi)抗炎藥物者；⑦近期外科手術(shù)史。

2.標(biāo)本的采集與保存 對(duì)所有參與此次研究的病例組及健康對(duì)照組成員在清晨空腹使用真空負(fù)壓EDTA-K2抗凝管采集肘靜脈血標(biāo)本5mL，將抗凝管上下輕輕顛倒使血液與抗凝劑充分混勻，標(biāo)寫(xiě)編號(hào)，-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫NA。

3.主要試劑 人外周血基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物有限公司)；DNA Marker(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖(西班牙Sigma公司)；5×TBE電泳緩沖液(上海生工生物工程有限公司)；2×TapPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)；DNA快速純化/回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；限制性?xún)?nèi)切酶Ear1(北京天根生化科技有限公司)；無(wú)水乙醇(西安浦化學(xué)試劑有限公司)，6×Loading Buffer緩沖液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

圖1 TNF-α-308位點(diǎn)酶切結(jié)果 A：AA 基因型：134bp；B：GA基因型：134bp、87bp、 20bp；C：GG 基因型：87bp和20bp,注：M：Marker帶

圖2 TNF-α-308位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果 A：野生型純合子GG型；B：突變 型雜合子GA型；C：突變型純合子AA型

4.主要儀器 低溫高速離心機(jī)(Heraeus公司，德國(guó))，1000型PCR擴(kuò)增儀和GelDoc2000凝膠成像儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，F(xiàn)R-250型電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司)，KDB-80型水浴箱(重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Eppendorf移液器(德國(guó))。

5. 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照Sakao S[11]等設(shè)計(jì)的TNF-α-308位點(diǎn)的引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。上游引物序列為5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′，下游引物序列為5′-GAGCGT CTGCTGGCTGGGTG -3′。

6.基因組DNA提取 按照說(shuō)明書(shū)應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒提取，將血液樣本取出，室溫下解凍，然后將全血顛倒混勻后，用移液器吸取3mL全血至無(wú)菌離心管內(nèi)加入細(xì)胞裂解液，使其充分與血液混勻后10 000r/min離心5min，棄上清液重復(fù)上述步驟1～2次后向每個(gè)離心管內(nèi)加入異丙醇進(jìn)行充分顛倒混勻直至出現(xiàn)白色絮狀物(即DNA)。

7.采用PCR法檢測(cè)樣本DNA PCR總反應(yīng)體系30μL，DNA模板3μL，10×Buffer 5μL，上游下游引物各3μL， Taq DNA聚合酶10μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至總反應(yīng)體系30μL。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件為：95℃,5min,預(yù)變性5min，共35個(gè)循環(huán)，其中95℃,變性30s，63℃,退火40s，72℃,延伸60s，末次延伸72℃,10min終止反應(yīng)，4℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠電泳成像儀下觀察樣品擴(kuò)增的情況。

為進(jìn)一步驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型，隨機(jī)選取純化后的三種基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行基因序列分析，。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)各組間基因型和基因頻率數(shù)進(jìn)行采用χ2檢驗(yàn)； Hardy- Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析，計(jì)算OR和95%可信區(qū)間用來(lái)檢測(cè)TNF-α-308位點(diǎn)基因多態(tài)性和COPD的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TNF-α-308位點(diǎn)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)基因分型 基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被限制性?xún)?nèi)切酶處理后，經(jīng)檢驗(yàn)擴(kuò)增良好，無(wú)非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小與實(shí)際相符，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α-308存在以下3種基因型：GG、GA、AA，其中GG為野生型純合子，片段長(zhǎng)度為87bp和20bp，GA為突變型雜合子，片段長(zhǎng)度為134bp、87bp和20bp，AA為突變型純合子，片段長(zhǎng)度為134bp。見(jiàn)圖1。

2.TNF-α-308測(cè)序結(jié)果及基因型的判定 采用反向測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)測(cè)序圖進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果顯示，TNF-α-308位點(diǎn)存在3種基因型：GG、GA和AA，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡吻合度檢驗(yàn) 根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，通過(guò)卡方檢驗(yàn)分別統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)個(gè)體中TNF-α-308位點(diǎn)的3種基因型：GG、GA和AA，結(jié)果顯示各組TNF-α -308位點(diǎn)的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遺傳平衡定律(P>0.05)，說(shuō)明樣本具有群體代表性，可以反映兩民族人群基因的整體分布情況。

表1 兩民族間TNF-α-308位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的比較[n(%)]

表2 兩民族間TNF-α-308位點(diǎn)的基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系[n(%)]

4.兩個(gè)民族TNF-α-308位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布的比較 新疆維吾爾族和哈薩克族的COPD組和對(duì)照組中，TNF-α-308位點(diǎn)均以GG基因型及G等位基因多見(jiàn)，兩組比較COPD組的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于對(duì)照組，且兩組間的基因型及等位基因頻率的分布，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

5.TNF-α-308位點(diǎn)的基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系 通過(guò)Logistic 回歸分析，以研究對(duì)象是否患COPD為因變量，以年齡、性別、三種基因型為協(xié)變量，調(diào)整年齡、性別后進(jìn)一步分析結(jié)果顯示：維吾爾族和哈薩克族COPD組AG基因型(46.3%，35%)、AA基因型(10%，6.3%)及A等位基因頻率(30%，25.6%)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，OR=0.149，95%CI=0.041～0.375；P=0.001，OR=0.158，95%CI=0.079～0.389；P=0.001，OR=0.107，95%CI=0.012～0.821；P=0.013，OR=0.357，95%CI=0.054～2.121；P=0.015，OR=0.323，95%CI=0.132～0.807；P=0.015，OR=0.343，95%CI=0.189～0.821)，提示攜帶AG和AA基因型的患者COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，A等位基因可能是COPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

討 論

COPD 是一種由多個(gè)易感基因參與的復(fù)雜疾病，氣流受限不完全可逆且呈進(jìn)行性的發(fā)展，受外部環(huán)境、宿主自身等因素的聯(lián)合作用在肺的不同部位，激活中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞等產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而加重COPD 的發(fā)生[10]，且不同的基因以及不同的環(huán)境因素，在不同COPD 患者人群中的發(fā)病機(jī)制不同[12]。研究發(fā)現(xiàn)其遺傳方式是每個(gè)基因只發(fā)揮一部分作用，并不是單個(gè)主基因發(fā)揮作用這不符合單基因遺傳方式，這提示COPD 的發(fā)病具有一定的遺傳性，目前已發(fā)現(xiàn)有多種基因與COPD 的易感性有關(guān)，并且在地域及種族方面存在著差異，因此有必要進(jìn)一步了解多種遺傳因素的作用機(jī)制及其在COPD發(fā)展中的作用，為COPD的預(yù)防和診療工作提供理論依據(jù)。

COPD 是以氣道、肺血管和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥為其主要的病理特點(diǎn)，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致小氣道、肺泡壁及肺結(jié)締組織損傷，最終導(dǎo)致COPD 的發(fā)生。COPD 患者肺內(nèi)被激活的炎癥細(xì)胞可釋放多種炎癥因子，包括TNF-α、白三烯、白介素等，這些炎癥因子可增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而使肺組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，因此COPD 發(fā)病中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是氣道炎癥[3]。TNF-α 是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，具有多種功能和廣泛的生物學(xué)特性，由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠改變平滑肌細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)氣道重構(gòu)，參與調(diào)節(jié)肺部炎癥，因此被認(rèn)為在慢性肺疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用。TNF-α影響肺功能的可能機(jī)制如下：①TNF-α可增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的黏著、趨化及侵潤(rùn)過(guò)程，使脂類(lèi)介質(zhì)、活性氧自由基及細(xì)胞因子等釋放增多，是重要的炎癥反應(yīng)介質(zhì)；②可能使血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，使毛細(xì)血管滲漏，使肺嚴(yán)重?fù)p傷，從而使肺功能下降；③TNF-α還能誘導(dǎo)黏附因子的合成與釋放，造成組織纖維增生，進(jìn)而使氣道重塑肺功能受損加重。TNF-α的基因多態(tài)性與它的功能相關(guān)，基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性可能會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄水平[13]。由于TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)-308 位點(diǎn)G/A 突變能顯著影響TNF-α基因的表達(dá)水平，提示TNF -α基因-308多態(tài)性在COPD 的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[14]，TNF-α基因的腺嘌呤(A)/鳥(niǎo)嘌呤(G)在-308 位點(diǎn)上有轉(zhuǎn)換，當(dāng)脂多糖刺激時(shí)A 等位基因的雜合子個(gè)體，產(chǎn)生的TNF-α較GG 基因型多。Sakao等[11]用PCR 技術(shù)檢測(cè)日本群體中對(duì)照組和COPD 組的血淋巴細(xì)胞基因DNA，發(fā)現(xiàn)TNF-α基因型在兩者間有明顯不同，且-308位點(diǎn)AA 純合子和GA 雜合子基因型都使COPD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。而在白種人群中的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩組之間的基因型有差異[15]。國(guó)內(nèi)對(duì)TNF-α-308與COPD的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，TNF-α-308位點(diǎn)的多態(tài)性與亞洲人群COPD的發(fā)病相關(guān)，漢族人群在排除了年齡、性別、吸煙等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響外，TNF-α-308等位基因與COPD患者的易感性存在相關(guān)性。而龔燕等[18]在漢族人中的研究結(jié)果顯示，該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與COPD的易感性無(wú)關(guān)。王妨娥、吳水淼等[19-20]，在對(duì)新疆維吾爾族和哈薩克族TNF-α-308位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD易感性的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308位點(diǎn)的基因型和等位基因的頻率在COPD組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α-A等位基因可能是COPD的危險(xiǎn)因素。目前有關(guān)COPD 與TNF-α基因-308 多態(tài)性的相關(guān)性研究中，其分析結(jié)果在不同的種族并不一致，因此有必要繼續(xù)對(duì)其他種族 TNF-α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)性與COPD的相關(guān)性做進(jìn)一步的研究，以確定該位點(diǎn)的基因多態(tài)性在COPD 發(fā)生發(fā)展中的作用。

本研究中各組基因型的分布，根據(jù)基因測(cè)序的結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)TNF-α-308位點(diǎn)的3種基因型：GG、GA和AA結(jié)果顯示，各組TNF-α -308位點(diǎn)的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遺傳平衡定律(P>0.05)，說(shuō)明樣本具有群體代表性，可以反映維、哈兩民族人群基因的整體分布情況。我們通過(guò)對(duì)新疆維、哈兩民族TNF-α-308位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩組均以G等位基因及野生純合GG基因型多見(jiàn)，研究結(jié)果顯示COPD組的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于對(duì)照組，且兩組間的基因型及等位基因頻率的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α -308位點(diǎn)的A等位基因可能是新疆維吾爾族和哈薩克族COPD發(fā)病的高危因素，而攜帶A等位基因及AG和AA基因型的患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增加，提示TNF-α-308位點(diǎn)基因的多態(tài)性與新疆維、哈兩民族COPD的易感性相關(guān)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[21-22]相似，進(jìn)一步說(shuō)明TNF-α- 308位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD發(fā)病存在明顯的相關(guān)性。

綜上所述，TNF-α-308位點(diǎn)相關(guān)的基因型及等位基因頻率可以作為遺傳性標(biāo)記在臨床上進(jìn)行檢測(cè)，用于早期發(fā)現(xiàn)維吾爾族及哈薩克族COPD易感的高危人群，對(duì)于預(yù)防COPD的發(fā)展有著重要的意義，由于COPD在不同的種族及人群中的易感性，可能存在一定的差異，而且COPD是一種比較復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，因此我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量在后續(xù)的研究中，為最終揭示遺傳因素如何影響COPD 發(fā)生、發(fā)展的具體作用機(jī)制的進(jìn)一步深入研究提供理論依據(jù)。