袁楚婷 葛長江 宋現(xiàn)濤 張 閩 苑 飛 許 鋒

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈事件的重要因素。冠狀動(dòng)脈造影是臨床診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其只能評(píng)估冠狀動(dòng)脈管腔的狹窄程度，且對(duì)于血管狹窄程度的判定會(huì)受到術(shù)者的主觀影響。血管內(nèi)超聲(intravenous ultrasound,IVUS)不僅可以測量血管外彈力膜面積、管腔面積、斑塊面積、纖維帽厚度，還可以判斷斑塊性質(zhì)，并通過上述測得的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)一步計(jì)算斑塊負(fù)荷、偏心指數(shù)、重構(gòu)指數(shù)等重要參數(shù)，對(duì)斑塊進(jìn)行精確分析，因此對(duì)于冠狀動(dòng)脈易損斑塊的評(píng)估具有很高的臨床價(jià)值。

血小板的活化在冠狀動(dòng)脈易損斑塊的形成及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而鈣庫操縱性鈣通道(store operated calcium channel, SOCC)則在血小板活化過程中發(fā)揮重要作用。本研究以冠狀動(dòng)脈易損斑塊這一引致急性冠狀動(dòng)脈綜合征的主要因素為切入點(diǎn)，通過IVUS測定相關(guān)指標(biāo)判斷斑塊易損性，結(jié)合血小板SOCC在不同階段的變化水平，深入探討血小板鈣庫操縱性鈣通道蛋白與冠狀動(dòng)脈斑塊易損性的相關(guān)性。

資料與方法

1.一般資料 入選2015年1月1日至2016年8月31日,在北京安貞醫(yī)院住院行冠狀動(dòng)脈造影確診為單支單處冠狀動(dòng)脈臨界病變的患者118例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)超聲(美國波士頓科學(xué))分析斑塊性質(zhì)，分為穩(wěn)定斑塊組(SP組，n=76)和易損斑塊組(VP組，n=42)。采集血液標(biāo)本并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測法測定血小板鈣離子信號(hào)蛋白STIM1、Orai1、TRPC1水平，然后對(duì)VP組行介入治療，SP組予改善生活方式、控制危險(xiǎn)因素以及阿司匹林、硝酸酯類、β受體阻滯劑及他汀類等冠心病二級(jí)預(yù)防用藥保守治療。1年后對(duì)SP組患者復(fù)查IVUS，根據(jù)斑塊性質(zhì)變化分別分為進(jìn)展為易損斑塊組(SVP組，n=16)和未進(jìn)展為易損斑塊組(SSP組，n=60)，并復(fù)測血小板鈣離子信號(hào)蛋白水平。

排除標(biāo)準(zhǔn)：既往行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting,CABG)者；任意一處冠狀動(dòng)脈狹窄>75%或復(fù)雜冠狀動(dòng)脈病變者；心功能NYHA分級(jí)II級(jí)以上或心源性休克者；合并嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、感染性疾病者。

2.血小板SOCC含量測定 流式細(xì)胞學(xué)方法測定血小板STIMI1、Orail、TRPC1蛋白含量：EDTA抗凝全血-CD61標(biāo)記血小板-PBS液固定-羊血清封閉Fc受體、減少一抗非特異性結(jié)合-抗STIMI1、Orail、TRPC1單克隆抗體與靶蛋白結(jié)合-FITC熒光標(biāo)記-PBS液固定-流式細(xì)胞儀測定SOCC蛋白表達(dá)。

3.冠狀動(dòng)脈造影及IVUS指標(biāo)測量(1)冠狀動(dòng)脈造影檢查：經(jīng)橈/股動(dòng)脈入路行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)，取至少2個(gè)以上能夠充分暴露病變并相互垂直的投照體位判斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度。

(2)IVUS測定：使用Boston公司i Lab超聲診斷儀及 Atlantis SR Pro冠狀動(dòng)脈超聲成像導(dǎo)管，血管內(nèi)超聲探頭為 2.9 F，頻率40 MHz。IVUS檢查前予普通肝素3 000～5 000 U，并向靶血管內(nèi)注射硝酸甘油100～300μg，排除超聲導(dǎo)管保護(hù)鞘內(nèi)空氣，經(jīng)0.014英寸的導(dǎo)引導(dǎo)絲將超聲導(dǎo)管送至靶病變遠(yuǎn)端10mm處，以0.5 mm/s速度自動(dòng)回撤 IVUS 導(dǎo)管采集冠狀動(dòng)脈內(nèi)超聲影像，直至導(dǎo)管探頭至左主干或右冠開口。測量病變處血管外彈力膜面積(external elastic membranous area，EEMA)、最小管腔面積(minimum luminal area，MLA)以及參考血管外彈力膜面積(目標(biāo)病變近、遠(yuǎn)端10mm處)，計(jì)算斑塊面積(plaque area，PA=EEMA-LA)、斑塊負(fù)荷(plaque burden，PB=PA/EEMA×100%)、偏心指數(shù)(eccentric index，EI=斑塊最厚處厚度-同一截面斑塊最薄處厚度/斑塊最厚處厚度，EI>0.5為偏心性斑塊、EI<0.5為向心性斑塊)、重構(gòu)指數(shù)(remodeling index，RI=EEMA/近遠(yuǎn)端參考血管面積平均值，RI>1.05為正性重構(gòu)、RI<0.95為負(fù)性重構(gòu))，通過比較斑塊內(nèi)與血管外膜回聲分析斑塊性質(zhì)(分為脂質(zhì)斑塊、纖維斑塊、鈣化斑塊、混合斑塊)。所有血管段定量測定均選擇最狹窄血管橫截面于心臟舒張末期進(jìn)行分析。

(3)易損斑塊的IVUS特征：①纖維帽厚度<0.7mm；②脂質(zhì)核心面積>1.0mm2；③脂質(zhì)核心占斑塊面積>20%；④偏心斑塊；⑤斑塊內(nèi)無回聲。

冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果及IVUS圖像分析由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的心內(nèi)科介入醫(yī)師在不了解患者臨床和生化結(jié)果的情況下進(jìn)行分析。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，使用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 兩組IVUS相關(guān)指標(biāo)比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

表5 SVP組與SSP組IVUS相關(guān)指標(biāo)比較

結(jié) 果

1.研究對(duì)象的一般情況 VP組和SP組兩組間在性別、年齡、吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、血脂、空腹血糖、血肌酐，既往高血壓、糖尿病及高脂血癥病史等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組患者一般資料

2.治療前組研究人群的3種SOCC水平比較 VP組血小板STIM1、Orai1、TRPC1水平明顯高于SP組(P<0.05，表2)。VP組與SP組IVUS相關(guān)指標(biāo)比較見表3。

表2 治療前兩組患者3種SOCC水平比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

3.1年后SP組內(nèi)3種SOCC變化情況 1年后對(duì)SP組患者復(fù)查IVUS，其中16例進(jìn)展為VP(SVP組)，剩余60例仍為SP(SSP組)。SVP組血小板STIM1、Orai1、TRPC1水平明顯高于SSP組(P<0.05)，SSP組SOCC水平較治療前有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。SVP組與SSP組IVUS相關(guān)指標(biāo)比較見表5。

表4 1年后兩組3種SOCC水平比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

討 論

急性冠狀動(dòng)脈綜合征是目前中國成人心臟病住院和死亡的第一位殺手，而冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性是引致急性冠狀動(dòng)脈綜合征的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，近70%的急性冠狀動(dòng)脈事件并非由冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄引起，而是由冠狀動(dòng)脈易損斑塊(vulnerable plaque)破裂誘發(fā)血栓形成所致的急性閉塞所致[1]。而易損斑塊的冠狀動(dòng)脈造影特征大部分表現(xiàn)為臨界病變。冠狀動(dòng)脈臨界病變(borderline lesion)是指以冠狀動(dòng)脈造影直徑法測定狹窄程度為50%～70%的病變，又稱為“中等程度狹窄”。

長期以來，冠狀動(dòng)脈造影一直被認(rèn)為是診斷冠狀動(dòng)脈病變、判定狹窄程度和介入指征的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但冠狀動(dòng)脈造影僅能顯示被造影劑充填的管腔輪廓，無法判斷局部血管壁的病理結(jié)構(gòu)改變和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)，在評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變方面存在不可避免的缺陷[2]。而IVUS具有良好的血管穿透性，不僅能夠觀察管腔形態(tài)，還可顯示血管壁的詳細(xì)結(jié)構(gòu)及粥樣硬化斑塊的形態(tài)特征，對(duì)病變進(jìn)行精確的定量分析，對(duì)于臨界病變的評(píng)估具有一定意義[3]。

“易損斑塊”的概念是由Muller等[4]于1989年提出的，是指冠狀動(dòng)脈內(nèi)非阻塞性粥樣硬化斑塊，性質(zhì)不穩(wěn)定，具有破裂傾向。Naghavi等[5]歸納了易損斑塊的主要組織病理學(xué)特征，包括大的脂質(zhì)核心和薄的纖維帽，同時(shí)伴隨大量炎癥因子的浸潤。另外，斑塊形態(tài)學(xué)呈明顯偏心性、管腔狹窄、管腔的代償性擴(kuò)張即正性重構(gòu)等也被認(rèn)為是易損斑塊的重要組織病理學(xué)特征[6]。IVUS判斷易損斑塊參考參數(shù)為：斑塊內(nèi)脂核的面積>1mm2，脂核占斑塊面積比>20%，斑塊的纖維帽厚度<0.7mm[7]。

IVUS的原理是利用高頻超聲波，在血管內(nèi)呈現(xiàn)高分辨率的影像，可以全面分析血管壁和管腔的情況，被認(rèn)為是診斷冠心病的新的“金標(biāo)準(zhǔn)”。彩色編碼的虛擬組織超聲(IVUS-VH)克服了普通血管內(nèi)超聲空間分辨率低的缺點(diǎn)，可以區(qū)分血栓、脂核、纖維、鈣化等不同成分。近年來興起的超聲彈性成像技術(shù)根據(jù)不同組織在受到外力壓迫后發(fā)生變形的程度，將受壓前后回聲信號(hào)移動(dòng)幅度的變化轉(zhuǎn)化為實(shí)時(shí)彩色圖像，可以直觀評(píng)估冠狀動(dòng)脈斑塊易損性[8]。

在易損斑塊破裂誘發(fā)血栓形成的過程中，血小板的活化和聚集起到至關(guān)重要的作用。已知?jiǎng)用}粥樣硬化進(jìn)程中凋亡的血管平滑肌細(xì)胞是很強(qiáng)的血小板激活劑，同時(shí)還可以促進(jìn)凝血酶的生成[9]，而凝血酶是血小板最強(qiáng)的激活劑，活化的血小板聚集在富含凋亡細(xì)胞的區(qū)域，激活后可浸潤動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，其釋放的金屬基質(zhì)蛋白酶可分解斑塊中的纖維成分，使纖維帽變薄，從而引起斑塊破裂[10]。

血小板的活化是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，鈣離子作為胞內(nèi)第二信使偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)，廣泛參與調(diào)節(jié)大多數(shù)的細(xì)胞活動(dòng)，包括血小板活化。鈣離子信號(hào)通過胞內(nèi)鈣離子濃度的升高和降低來實(shí)現(xiàn)血小板的生物學(xué)功能。血小板胞漿內(nèi)鈣離子濃度的升高是血小板活化的標(biāo)志，也是血小板活化的始動(dòng)因素之一，并且全程參與到血小板活化、粘附、聚集以及血栓形成過程中[11]。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的上升，除了細(xì)胞內(nèi)鈣池鈣離子釋放外，還依賴于細(xì)胞外基質(zhì)中鈣離子的跨膜內(nèi)流。SOCC是非興奮性細(xì)胞胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道，參與了基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應(yīng)激等多種生理和病理生理過程。有研究表明Orai 1和 STIM 1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE通道的重要組成部分。Orai是近年來發(fā)現(xiàn)的一種位于細(xì)胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動(dòng)物Orai家族蛋白Orai 1-3主要參與SOCC鈣內(nèi)流孔道的構(gòu)成，其中Orai 1是最重要的SOCE效應(yīng)蛋白。而 STIM 家族蛋白STIM 1-2 主要作為胞內(nèi)鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時(shí)將這一信號(hào)傳遞到胞膜的SOCC，促使其開放，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。在哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)STIM1 是 SOCC 的重要調(diào)節(jié)分子，而 STIM2 主要與維持鈣庫的穩(wěn)定有關(guān)。STIM1 具有感受鈣池充盈狀態(tài)并將感受信號(hào)通過不同蛋白作用機(jī)制傳遞給Orai及TRPC通道的雙重功能，是共同介導(dǎo)SOCE的關(guān)鍵分子[12-14]。

同理，SOCC作為血小板基質(zhì)中鈣離子內(nèi)流的主要通道，其本身在血小板活化、血栓形成過程中地位非常重要。血小板中主要有兩種鈣池，其中最主要的鈣池稱為密管系統(tǒng)(dense tubular system，DTS)，類似于其他類型細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。另一個(gè)鈣池是溶酶體樣酸性細(xì)胞器(lysosome-like acidic organelles，LLAO)。受血小板內(nèi)兩個(gè)鈣池性質(zhì)、特點(diǎn)各不相同的影響，與每個(gè)鈣池對(duì)應(yīng)的SOCC亦發(fā)揮獨(dú)立的鈣內(nèi)流效應(yīng)[15]。相似的是，兩個(gè)不同的鈣池質(zhì)膜上都表達(dá)有STIM1蛋白分子[16]，作為鈣池上的鈣離子傳感器，STIM1負(fù)責(zé)大部分血小板基質(zhì)中游離鈣離子的內(nèi)流，其聯(lián)合血小板質(zhì)膜上跨膜蛋白Orai1共同調(diào)解，對(duì)鈣庫釋放鈣離子升高胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的作用發(fā)揮放大效應(yīng)[17-18]。國外有研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶激活血小板可以使Orai1蛋白表達(dá)上調(diào)[19]，血小板活化后可促進(jìn)更多凝血酶生成，使這一過程呈正反饋。而STIM1、Orai1及TRPC1在凝血誘導(dǎo)的血小板聚集中發(fā)揮重要作用[20]。

本研究結(jié)果表明，血小板STIM1、Orai1、TRPC1蛋白的表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊之間存在明顯相關(guān)性，即根據(jù)血小板SOCC表達(dá)水平預(yù)測斑塊易損性與IVUS判斷結(jié)果一致。因IVUS費(fèi)用昂貴、技術(shù)難度大、受病變條件限制等，其臨床應(yīng)用存在一定的局限性，而通過測定血小板SOCC表達(dá)水平預(yù)測易損斑塊則更易于在臨床推廣，但目前血小板SOCC測定條件復(fù)雜、技術(shù)要求較高，若能進(jìn)一步簡化SOCC測定流程，未來有望成為預(yù)測急性冠狀動(dòng)脈事件的臨床檢測指標(biāo)。本研究尚存在一定的局限性，未來可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步探索易損斑塊的病理機(jī)制，建立簡便、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)，篩選安全、可靠的治療方法，實(shí)現(xiàn)易損斑塊的早期識(shí)別，最終降低急性心血管事件的發(fā)生率和死亡率。