段嘉霖 陶婧雯 李林凌 劉 念 阮燕菲 聞松男 林 立 白 融 王 琳
目前在人和鼠的基因組中,已發(fā)現(xiàn)11種編碼電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channel, VGSC,以下簡(jiǎn)稱鈉通道)α亞單位的基因,依次命名為SCN1A—SCN11A[1]。在以往的理論中,心臟組織中的鈉離子通道主要是SCN5A編碼的Nav1.5,在心房肌細(xì)胞、心室肌細(xì)胞和特化的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中均大量表達(dá)[2]。Nav1.5通道中起到重要作用。然而,最近一系列證據(jù)表明,除了SCN5A,另一種鈉通道基因SCN10A同樣在心臟電生理中作用明顯。SCN10A基因位于3號(hào)染色體,恰好與SCN5A毗鄰。SCN10A編碼的鈉通道Nav1.8同Nav1.5一樣,也是河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)不敏感的鈉通道。之前的研究認(rèn)為,Nav1.8主要分布在脊髓后根的神經(jīng)系統(tǒng)中,參與痛覺的形成和傳導(dǎo),其突變與多種神經(jīng)痛性疾病相關(guān)[3]。然而近期多個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)性分析(genome-wide association study,GWAS)提示,SCN10A的突變與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能和多種心律失常密切相關(guān),其中包括心房顫動(dòng)、Brugada綜合征等[4-7]。這個(gè)出人意料的發(fā)現(xiàn)引起了電生理學(xué)者的強(qiáng)烈關(guān)注。本研究從組織水平探討SCN10A在心臟組織中的表達(dá)及其在心電生理中的作用,進(jìn)一步證實(shí)SCN10A在心臟電生理中具有重要的
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇:為Wistar大鼠(體質(zhì)量250~300g,雌雄不拘),華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供和新西蘭大耳兔。
(2)試驗(yàn)藥物:① ATX-II,購自Sigma公司,常用于建立LQT-3模型的藥物。② A-803467,購自Sigma公司,是選擇性Nav1.8阻斷劑,對(duì)Nav1.8的抑制呈濃度依賴性。③ 免疫組化中所需要用到的抗體:polyclonal anti-Nav1.8 (Sigma S2071; 1∶100 dilution); polyclonal anti-Nav1.5 (Alomone Laboratories SC-005; 1∶200 dilution); monoclonal anti-α-actinin (Sigma; 1∶1000 dilution); monoclonal anti-Tubb3 (Sigma T8660; 1∶200 dilution).
2.實(shí)驗(yàn)方法 (1)采用免疫組化探究SCN10A在心臟組織中的表達(dá) ① Wistar大鼠以0.4%戊巴比妥鈉1mL/100g腹腔注射麻醉,麻醉后取出心臟組織;② 取出大鼠心臟,快速冷凍于液氮中,保存于-80℃環(huán)境中。使用涂有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的玻片制作四腔心冰凍切片(片厚7μm)。室溫下,用含有0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)溶液破膜1h;用2%牛血清白蛋白封閉30min;一抗孵育,4℃過夜;再用二抗、10%正常山羊血清(NGS)室溫下孵育90min;用配有鏡頭的共聚焦激光掃描顯微鏡以568mm和488mm的激發(fā)光、605DF32和522DF35的散射光成像。
(2)兔楔形心肌塊實(shí)驗(yàn) ① 新西蘭大耳兔(體質(zhì)量3kg左右,雌雄不拘,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為四組,分別為正常對(duì)照組、正常+A-803467組、ATX-II組和ATX-II+A-803467組;② 靜脈注射麻醉兔子,取出心臟置于臺(tái)邊高鉀停跳液中;
③ 將心臟移至心肌塊制備臺(tái)的蠟臺(tái)上,將冠狀動(dòng)脈插管插入左冠狀動(dòng)脈口,打開灌流閥,縫線結(jié)扎。減去多余心臟組織,制成左心室楔形心肌塊;④ 將左心室心肌塊固定在灌流槽中,調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速,以S1S1刺激,基礎(chǔ)步長(zhǎng)1 000ms,觀察心肌搏動(dòng)及心電圖記錄情況,記錄內(nèi)、外膜動(dòng)作電位。待心肌塊電生理特性穩(wěn)定后將步長(zhǎng)調(diào)至2 000ms。30min后予以S1S2、S1S2S3程序刺激;⑤ 需記錄的參數(shù):內(nèi)膜90%動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)、外膜APD90、QT間期、心律失常事件的發(fā)生率。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.SCN10A在心臟組織中的表達(dá)及分布 通過免疫熒光證實(shí)SCN10A在心臟組織中有表達(dá)(圖1)。此后又使用共染色的方法,在顯示Nav1.8的同時(shí),分別對(duì)心肌組織和心內(nèi)神經(jīng)組織進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)Nav1.8在心肌組織和心臟神經(jīng)組織上均有表達(dá)(圖2~3)。
圖1 SCN10A編碼的鈉通道Nav1.8在心臟組織中有表達(dá)(100×),注: Nav1.8為綠色 熒光
圖2 SCN10A在普通心肌組織中有表達(dá)(100×)注: 綠色的熒光表示Nav1.8,紅色的熒光表 示α-actinin(心肌組織的特異性抗體)
圖3 SCN10A在心臟神經(jīng)組織中有表達(dá)(100×)注:綠色熒光代表Nav1.8,紅色熒光 代表Tubb3(神經(jīng)組織標(biāo)志物)
2. SCN10A在心臟電生理中的作用 (1) 各組外膜APD90、內(nèi)膜APD90、TDR以及QT間期兔左心室楔形心肌塊模型在S1S1刺激,步長(zhǎng)為2 000ms時(shí)內(nèi)膜APD90、外膜APD90、QT間期的測(cè)量值見表1。由表1可見,和正常對(duì)照組相比,正常+A-803467組的內(nèi)、外膜APD90和QT間期無明顯變化;而ATX-II組外膜APD90、內(nèi)膜APD90和QT間期均較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示鈉通道開放劑ATX-II可明顯延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期;同時(shí),ATX-II+A-803467組外膜APD90、內(nèi)膜APD90和QT間期較ATX-II組明顯縮短,TDR也明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明使用A-803467特異性地阻斷Nav1.8,可以縮短ATX-II引起的動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期的延長(zhǎng)。
ATX-II為鈉通道開放劑,主要通過增大晚鈉電流以延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期,而特異性阻斷Nav1.8能夠減弱這種作用,從組織水平上說明了SCN10A/Nav1.8是晚鈉電流的重要組成成分。
表1 選擇性Nav1.8阻斷劑A-803467對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期的影響
注:ATX-II組與其他三組比較,*P<0.05; ATX-II+A-803467組與ATX-II組比較,#P<0.05
(2)各組心律失常事件發(fā)生率的比較 經(jīng)過S1S1、S1S2、S1S2S3程序刺激后,正常對(duì)照組、正常+A-803467組、ATX-II組、ATX-II+A-803467組的心律失常事件發(fā)生率依次為零、零、57.1%、零。ATX-II組心律失常事件較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.05),說明ATX-II通過開放鈉通道導(dǎo)致晚鈉電流增強(qiáng),從而增加了心律失常事件發(fā)生率。而ATX-II+A-803467組的心律失常事件發(fā)生率較ATX-II組明顯減少(P<0.05),提示A-803467可通過特異性阻斷Nav1.8產(chǎn)生抗心律失常作用。
關(guān)于SCN10A在心臟中的表達(dá)及其在心電生理中的作用,目前仍有很大的爭(zhēng)議。Sotoodehnia等[8]發(fā)現(xiàn)SCN10A主要表達(dá)在鼠的希氏-浦肯野系統(tǒng)中,而在普通心肌細(xì)胞中表達(dá)較少。而Verkerk等[9]通過免疫組化等實(shí)驗(yàn)表明,SCN10A表達(dá)于鼠心臟的神經(jīng)元細(xì)胞,而在普通心肌細(xì)胞中未見表達(dá)。關(guān)于人心肌組織SCN10A的表達(dá),Boogaard等[10]通過RT-PCR等技術(shù)證實(shí),在人的心臟組織中,SCN10A的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于SCN5A,且在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)(如房室結(jié)等部位)中未見SCN10A的表達(dá)。Facer等[11]通過免疫組化等實(shí)驗(yàn)證實(shí),在人的心耳組織中,SCN10A在神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞中都有表達(dá)。本研究認(rèn)為,SCN10A編碼的Nav1.8在心肌細(xì)胞和心臟神經(jīng)組織中都有表達(dá)。如前所述,SCN10A在心肌細(xì)胞中的表達(dá),很可能就在浦肯野纖維中。浦肯野纖維相比普通工作肌細(xì)胞具有更長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程,這可能與SCN10A/Nav1.8有關(guān),因?yàn)橄啾扔贜av1.5,Nav1.8產(chǎn)生的動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長(zhǎng)[12]。SCN10A在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá),可能會(huì)影響心臟神經(jīng)系統(tǒng)的功能,與心律失常事件相關(guān)。
本研究使用兔左心室楔形心肌塊模型,在組織水平證實(shí)Nav1.8是晚鈉電流的重要組成部分,且使用A-803467特異性地阻斷Nav1.8具有抗心律失常作用。同時(shí)我們猜測(cè),特異性阻斷Nav1.8可能影響心肌組織中神經(jīng)細(xì)胞的功能,從而間接影響心肌組織的心電生理特性。
綜上所述,SCN10A在心臟中的表達(dá)和在心臟電生理中的作用仍有較大爭(zhēng)議。本研究初步探究了這一問題,證實(shí)SCN10A在大鼠心肌組織中有表達(dá),且在組織水平上證實(shí)了SCN10A/Nav1.8是晚鈉電流的重要組成部分,特異性阻斷Nav1.8具有抗心律失常的作用。本研究的結(jié)果將進(jìn)一步豐富SCN10A與心臟電生理這一問題的相關(guān)理論,拓寬了有關(guān)心律失常,尤其是室性心律失常發(fā)生機(jī)制的研究思路,為進(jìn)一步的研究提供理論和方法的基礎(chǔ)。