段嘉霖 陶婧雯 李林凌 劉 念 阮燕菲 聞松男 林 立 白 融 王 琳

目前在人和鼠的基因組中，已發(fā)現(xiàn)11種編碼電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channel, VGSC，以下簡稱鈉通道)α亞單位的基因，依次命名為SCN1A—SCN11A[1]。在以往的理論中，心臟組織中的鈉離子通道主要是SCN5A編碼的Nav1.5，在心房肌細胞、心室肌細胞和特化的心臟傳導系統(tǒng)中均大量表達[2]。Nav1.5通道中起到重要作用。然而，最近一系列證據表明，除了SCN5A，另一種鈉通道基因SCN10A同樣在心臟電生理中作用明顯。SCN10A基因位于3號染色體，恰好與SCN5A毗鄰。SCN10A編碼的鈉通道Nav1.8同Nav1.5一樣，也是河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)不敏感的鈉通道。之前的研究認為，Nav1.8主要分布在脊髓后根的神經系統(tǒng)中，參與痛覺的形成和傳導，其突變與多種神經痛性疾病相關[3]。然而近期多個全基因組關聯(lián)性分析(genome-wide association study，GWAS)提示，SCN10A的突變與心臟傳導系統(tǒng)功能和多種心律失常密切相關，其中包括心房顫動、Brugada綜合征等[4-7]。這個出人意料的發(fā)現(xiàn)引起了電生理學者的強烈關注。本研究從組織水平探討SCN10A在心臟組織中的表達及其在心電生理中的作用，進一步證實SCN10A在心臟電生理中具有重要的

材料與方法

1. 實驗動物和試劑 (1)實驗動物選擇：為Wistar大鼠(體質量250～300g，雌雄不拘)，華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供和新西蘭大耳兔。

(2)試驗藥物：① ATX-II，購自Sigma公司，常用于建立LQT-3模型的藥物。② A-803467，購自Sigma公司，是選擇性Nav1.8阻斷劑，對Nav1.8的抑制呈濃度依賴性。③ 免疫組化中所需要用到的抗體：polyclonal anti-Nav1.8 (Sigma S2071; 1∶100 dilution); polyclonal anti-Nav1.5 (Alomone Laboratories SC-005; 1∶200 dilution); monoclonal anti-α-actinin (Sigma; 1∶1000 dilution); monoclonal anti-Tubb3 (Sigma T8660; 1∶200 dilution).

2.實驗方法 (1)采用免疫組化探究SCN10A在心臟組織中的表達 ① Wistar大鼠以0.4%戊巴比妥鈉1mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉后取出心臟組織；② 取出大鼠心臟，快速冷凍于液氮中，保存于-80℃環(huán)境中。使用涂有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的玻片制作四腔心冰凍切片(片厚7μm)。室溫下，用含有0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)溶液破膜1h；用2%牛血清白蛋白封閉30min；一抗孵育，4℃過夜；再用二抗、10%正常山羊血清(NGS)室溫下孵育90min；用配有鏡頭的共聚焦激光掃描顯微鏡以568mm和488mm的激發(fā)光、605DF32和522DF35的散射光成像。

(2)兔楔形心肌塊實驗 ① 新西蘭大耳兔(體質量3kg左右，雌雄不拘，華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供)，隨機分為四組，分別為正常對照組、正常+A-803467組、ATX-II組和ATX-II+A-803467組；② 靜脈注射麻醉兔子，取出心臟置于臺邊高鉀停跳液中；

③ 將心臟移至心肌塊制備臺的蠟臺上，將冠狀動脈插管插入左冠狀動脈口，打開灌流閥，縫線結扎。減去多余心臟組織，制成左心室楔形心肌塊；④ 將左心室心肌塊固定在灌流槽中，調節(jié)恒流泵轉速，以S1S1刺激，基礎步長1 000ms，觀察心肌搏動及心電圖記錄情況，記錄內、外膜動作電位。待心肌塊電生理特性穩(wěn)定后將步長調至2 000ms。30min后予以S1S2、S1S2S3程序刺激；⑤ 需記錄的參數(shù)：內膜90%動作電位時程(APD90)、外膜APD90、QT間期、心律失常事件的發(fā)生率。

3.統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包。首先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，計量資料以均數(shù) 標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．SCN10A在心臟組織中的表達及分布 通過免疫熒光證實SCN10A在心臟組織中有表達(圖1)。此后又使用共染色的方法，在顯示Nav1.8的同時，分別對心肌組織和心內神經組織進行染色，發(fā)現(xiàn)Nav1.8在心肌組織和心臟神經組織上均有表達(圖2～3)。

圖1 SCN10A編碼的鈉通道Nav1.8在心臟組織中有表達(100×),注: Nav1.8為綠色 熒光

圖2 SCN10A在普通心肌組織中有表達(100×)注: 綠色的熒光表示Nav1.8，紅色的熒光表 示α-actinin(心肌組織的特異性抗體)

圖3 SCN10A在心臟神經組織中有表達(100×)注:綠色熒光代表Nav1.8，紅色熒光 代表Tubb3(神經組織標志物)

2. SCN10A在心臟電生理中的作用 (1) 各組外膜APD90、內膜APD90、TDR以及QT間期兔左心室楔形心肌塊模型在S1S1刺激，步長為2 000ms時內膜APD90、外膜APD90、QT間期的測量值見表1。由表1可見，和正常對照組相比，正常+A-803467組的內、外膜APD90和QT間期無明顯變化；而ATX-II組外膜APD90、內膜APD90和QT間期均較正常對照組明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示鈉通道開放劑ATX-II可明顯延長動作電位時程和QT間期；同時，ATX-II+A-803467組外膜APD90、內膜APD90和QT間期較ATX-II組明顯縮短，TDR也明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明使用A-803467特異性地阻斷Nav1.8，可以縮短ATX-II引起的動作電位時程和QT間期的延長。

ATX-II為鈉通道開放劑，主要通過增大晚鈉電流以延長動作電位時程和QT間期，而特異性阻斷Nav1.8能夠減弱這種作用，從組織水平上說明了SCN10A/Nav1.8是晚鈉電流的重要組成成分。

表1 選擇性Nav1.8阻斷劑A-803467對動作電位時程和QT間期的影響

注：ATX-II組與其他三組比較,*P<0.05； ATX-II+A-803467組與ATX-II組比較，#P<0.05

(2)各組心律失常事件發(fā)生率的比較 經過S1S1、S1S2、S1S2S3程序刺激后，正常對照組、正常+A-803467組、ATX-II組、ATX-II+A-803467組的心律失常事件發(fā)生率依次為零、零、57.1%、零。ATX-II組心律失常事件較正常對照組明顯增多(P<0.05)，說明ATX-II通過開放鈉通道導致晚鈉電流增強，從而增加了心律失常事件發(fā)生率。而ATX-II+A-803467組的心律失常事件發(fā)生率較ATX-II組明顯減少(P<0.05)，提示A-803467可通過特異性阻斷Nav1.8產生抗心律失常作用。

討 論

關于SCN10A在心臟中的表達及其在心電生理中的作用，目前仍有很大的爭議。Sotoodehnia等[8]發(fā)現(xiàn)SCN10A主要表達在鼠的希氏-浦肯野系統(tǒng)中，而在普通心肌細胞中表達較少。而Verkerk等[9]通過免疫組化等實驗表明，SCN10A表達于鼠心臟的神經元細胞，而在普通心肌細胞中未見表達。關于人心肌組織SCN10A的表達，Boogaard等[10]通過RT-PCR等技術證實，在人的心臟組織中，SCN10A的表達水平遠低于SCN5A，且在心臟傳導系統(tǒng)(如房室結等部位)中未見SCN10A的表達。Facer等[11]通過免疫組化等實驗證實，在人的心耳組織中，SCN10A在神經元細胞和心肌細胞中都有表達。本研究認為，SCN10A編碼的Nav1.8在心肌細胞和心臟神經組織中都有表達。如前所述，SCN10A在心肌細胞中的表達，很可能就在浦肯野纖維中。浦肯野纖維相比普通工作肌細胞具有更長的動作電位時程，這可能與SCN10A/Nav1.8有關，因為相比于Nav1.5，Nav1.8產生的動作電位時程明顯延長[12]。SCN10A在神經系統(tǒng)的表達，可能會影響心臟神經系統(tǒng)的功能，與心律失常事件相關。

本研究使用兔左心室楔形心肌塊模型，在組織水平證實Nav1.8是晚鈉電流的重要組成部分，且使用A-803467特異性地阻斷Nav1.8具有抗心律失常作用。同時我們猜測，特異性阻斷Nav1.8可能影響心肌組織中神經細胞的功能，從而間接影響心肌組織的心電生理特性。

綜上所述，SCN10A在心臟中的表達和在心臟電生理中的作用仍有較大爭議。本研究初步探究了這一問題，證實SCN10A在大鼠心肌組織中有表達，且在組織水平上證實了SCN10A/Nav1.8是晚鈉電流的重要組成部分，特異性阻斷Nav1.8具有抗心律失常的作用。本研究的結果將進一步豐富SCN10A與心臟電生理這一問題的相關理論，拓寬了有關心律失常，尤其是室性心律失常發(fā)生機制的研究思路，為進一步的研究提供理論和方法的基礎。