楊永杰 高麗 章嵐

摘 要：目的：研究水平跑臺(tái)訓(xùn)練后生長期大鼠PBMCs中TGFβ/BMPs信號途徑的Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表達(dá)水平，探索上述基因表達(dá)變化與骨重塑狀態(tài)的關(guān)系。方法：24只2月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分成對照組和運(yùn)動(dòng)組，每組各12只。運(yùn)動(dòng)組以25 m/min， 50 min/d，5 d/w水平運(yùn)動(dòng)12 w。訓(xùn)練結(jié)束后測量離體大鼠脛骨BMD及骨形態(tài)；用QRT-PCR檢測PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，運(yùn)動(dòng)后大鼠脛骨的長度和近端BMD、BMC及厚度變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PBMCs中Hes1、Gpnmb和Col1a1 mRNA表達(dá)上調(diào)，Mmp8 mRNA表達(dá)下調(diào)，Mitf、Smad7和Klf4表達(dá)未發(fā)生顯著變化。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)后PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表達(dá)變化能比較敏感地反映骨重塑狀態(tài)，提示上述基因可作為反應(yīng)運(yùn)動(dòng)對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：生長期大鼠；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；PBMCs；骨重塑；TGFβ/BMPs

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-2076（2018）02-0070-05

Abstract：Objective： To explore the involvement of the TGFβ/BMPs pathway related genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 of peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） in growing rats with treadmill training， thus to uncover the relationship between the Genes and bone remodeling caused by exercise. Methods： Two-month-old male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into two groups： control group （n=12） and exercise group（n=12）. The rats in the exercise group received leveling treadmill running treatment 5 days per week for 12 weeks according to the exercise regimen consisted of running at 25 m/min for 50 min each day. The final training was finished. Then the bone mineral density （BMD） and the morphological change of tibia was measured. PBMCs was harvested， and the mRNA expression of Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs were detected. Results： Compared with the control group， no effect was found on the BMD and the morphological change of the tibia in exercise group. While the treadmill training up-regulated the Hes1， Gpnmb and Col1a1 mRNA transcription， down-regulated the Mmp8 transcripts， but had no effect on Mitf， Smad7 and Klf4 transcription. Conclusion： The mRNA transcript alteration of genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs was more sensitive to exercise， and these genes may serve as molecular marker candidates for bone remodeling.

Key words：growing rats； treadmill； PBMCs； bone remodeling； TGFβ/BMPs

青春期適當(dāng)?shù)剡\(yùn)動(dòng)可提高峰值骨量，預(yù)防骨質(zhì)疏松，但運(yùn)動(dòng)不當(dāng)則不利于健骨。運(yùn)動(dòng)對骨密度和骨量的影響在短期內(nèi)不易檢測到，故對骨密度和骨量的檢測不利于快速有效科學(xué)地指導(dǎo)健骨運(yùn)動(dòng)。顯示骨密度和股形態(tài)的測定指標(biāo)在運(yùn)動(dòng)干預(yù)骨重塑中靈敏度低，反映骨代謝的分子標(biāo)記可及時(shí)監(jiān)測運(yùn)動(dòng)干預(yù)骨代謝的變化，但在機(jī)械應(yīng)力下能反映骨代謝的分子標(biāo)記尚待研究。β轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowth factor-beta，TGF-β）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在骨代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。轉(zhuǎn)錄抑制因子（Hairyand enhancer of split homolog-1，Hes1）[2]、非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B （Glycoproteinnonmetastaticmelanomaprotein b，Gpnmb） 基因及其蛋白Osteoactivin（OA）[3]、Col1a1[4]、基質(zhì)金屬蛋白酶8（matrix metalloproteinase，Mmp8）[5]、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf）[6]、Smad7[7]和Krüppel樣因子4 （Kruppel-like factor 4，Klf4）[8-9]參與TGFβ/BMPs信號途徑，對骨重塑起作用。

外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，均參與骨代謝過程調(diào)節(jié)[10-11]。先前我們已對PBMCs中wnt信號途徑相關(guān)骨重塑基因進(jìn)行了報(bào)道[12]。有關(guān)運(yùn)動(dòng)對PBMCs中TGFβ/BMPs信號途徑骨代謝相關(guān)基因的影響尚未見報(bào)道。骨重塑是個(gè)復(fù)雜過程，TGF-β/ BMPs信號途徑與WNT信號途徑在骨重塑中有交互作用。研究PBMCs中TGF-β/ BMPs信號途徑中作用，為研究運(yùn)動(dòng)后不同信號對骨重塑的調(diào)節(jié)具有重要意義。

山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)第34卷第2期2018年4月 楊永杰，等 TGFβ/BMPs信號通路相關(guān)基因在運(yùn)動(dòng)干預(yù)骨重塑中的研究No.2 2018本文對2月齡雄性SD大鼠進(jìn)行12周跑臺(tái)訓(xùn)練，觀察其脛骨骨密度及形態(tài)學(xué)變化，并分離PBMCs以檢測TGFβ/BMPs信號途徑相關(guān)基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達(dá)變化，為運(yùn)動(dòng)健骨提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

24只2月齡雄性SD大鼠，體重247.9±8.0克（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所）。單籠飼養(yǎng)，自由飲食，環(huán)境溫度24℃±2℃，相對濕度55%±5%，每天保持12 h光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)后被隨機(jī)分為對照組（n=12）和運(yùn)動(dòng)組（n=12）。

1.2 研究方法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)方案

對照組大鼠自然籠養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)組大鼠在動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行水平跑訓(xùn)練12 w，5 d/w。運(yùn)動(dòng)從第1周10 m/min，10 min/d開始到第4周最后逐漸增加到25 m/min，50 min/d。5～12周維持25 m/min，50 min/d這一強(qiáng)度[12]。

1.2.2 脛骨的獲取、脛骨形態(tài)測量和骨密度檢測

最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束24 h后，乙醚麻醉大鼠，剝離脛骨，測量脛骨長度、近端厚度與寬度（精確到0.02 mm）。用DEXA、XR-600骨密度儀檢測離體脛骨的近端骨密度，檢測如圖1所示。

1.2.3 外周血液PBMCs獲取、總RNA的提取和QRT-PCR檢測

腹主動(dòng)脈取血。同組的隨機(jī)5只大鼠血液等量充分混合以平衡個(gè)體差異，每組分別取2 ml血液，按照大鼠外周血液單個(gè)核細(xì)胞分離液（GE healthcare）試劑盒說明分離PBMCs。利用總RNA提取試劑盒（OMEGA）提取總mRNA，純化后質(zhì)檢（A260/A280≥1.90；總量≥1 μg）。用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物（見表1），以β-Actin作為參照，取純化后總RNA（500 ng）用SYBR-Green （Roche）在實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad）進(jìn)行QRT-PCR。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)用spss11.1中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用mean±SD表示， 以P<0.05為差異顯著。QRT-PCR擴(kuò)增的mRNA水平用2 - △△CT表示， 2 - △△CT值>2（或<0.5）為表達(dá)具有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)束后大鼠脛骨骨密度及其形態(tài)的比較

由表2可知：12周水平跑臺(tái)訓(xùn)練后，與對照組相比，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后大鼠脛骨長度及脛骨近端厚度、寬度和BMD變化倍數(shù)分別為1.00、0.98、1.00和1.01，變化都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明該強(qiáng)度的持續(xù)耐力運(yùn)動(dòng)對健康生長期雄性大鼠脛骨的BMD及脛骨形態(tài)影響不大。

2.2 QRT-PCR檢測Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因mRNA的表達(dá)變化

對照組和運(yùn)動(dòng)組PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達(dá)QRT-PCR檢測結(jié)果如表3所示。與對照組相比，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后大鼠PBMCs中基因Hes1、Gpnmb和Col1a1的mRNA表達(dá)上調(diào)，表達(dá)變化倍數(shù)分別為2.12、4.01和5.26；基因Mmp8的mRNA表達(dá)則下調(diào)，表達(dá)變化倍數(shù)為0.22，Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達(dá)變化倍數(shù)分別為1.18、1.64和1.23，雖略有增加但不具有顯著性差異。其中Col1a1和Mmp8的表達(dá)倍數(shù)變化大于或等于5。

3 討論

3.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對生長期大鼠脛骨的BMD及形態(tài)的影響

生長期合理的耐力運(yùn)動(dòng)均使骨形成增加。我們已報(bào)道在本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案下水平跑臺(tái)訓(xùn)練后骨微結(jié)構(gòu)改善[12]，這與Ju等[13]的結(jié)論一致，即本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案可使骨質(zhì)改善。但運(yùn)動(dòng)后脛骨近端骨密度和脛骨的形態(tài)沒有檢測到顯著性變化，這與我們已報(bào)到的該強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對整體骨密度及骨礦含量和股骨骨密度的影響結(jié)果相同[12]。這些結(jié)果揭示骨密度和骨形態(tài)等指標(biāo)的檢測靈敏度低，不利于及時(shí)反映運(yùn)動(dòng)對骨重塑的干預(yù)。

3.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后Hes1、Gpnmb 、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因表達(dá)水平

經(jīng)典TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與骨重塑密切相關(guān)[14-15]；TGF-β/ BMPs通路還可與其他骨代謝相關(guān)通路如 WNT、MAPK、NOTCH、HEDGEHOG等交互作用[16]。Hes1[2]、Gpnmb[1，3] 、Col1a1[4] 和Mitf[6]是TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶基因；Mmp8、Smad7和 Klf4[8-9]可調(diào)節(jié)TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]，它們都參與骨重塑調(diào)節(jié)。

3.2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后Hes1、Gpnmb、Col1a1和Mmp8基因表達(dá)水平的變化

Hes1是NOTCH經(jīng)典信號的重要下游靶基因[2]。Hes1調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因的轉(zhuǎn)錄活性[17]。骨髓NOTCH信號可通過抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育抑制骨的重建 [18]。同時(shí)Hes1 也是TGF-β/BMPs信號途徑的靶基因。TGF-β/BMPs信號通路活化后上調(diào) Hes1 基因的表達(dá) [1-2]。據(jù)公認(rèn)，Gpnmb/OA在生理和病理?xiàng)l件下正調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化 [19-20]。OA蛋白在BMP-2的下游起作用，敲除Gpnmb可部分地減小BMP-2對成骨細(xì)胞分化和功能的效果[1，20]，OA和TGF-β1之間可能存在關(guān)聯(lián)[3]。OA也可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和/或活性，是破骨細(xì)胞分化和存活的負(fù)調(diào)節(jié)物[21]，但抗體中和抑制OA的功能可降低破骨細(xì)胞的細(xì)胞大小、細(xì)胞核數(shù)量、融合和骨吸收活性 [22]。Gpnmb突變或OA被抗體阻斷會(huì)抑制破骨細(xì)胞的功能，降低骨轉(zhuǎn)換 [3]。Col1a1是成骨細(xì)胞的特異性基因[23]，編碼Ⅰ型膠原，促進(jìn)骨形成 [24]。在間充質(zhì)細(xì)胞、前成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均可檢測到Col1a1表達(dá)。I型膠原在TGF-β與受體結(jié)合后合成增加，參與骨和軟骨的合成。Mmp8是 Mmps家族中的成員，其蛋白MMP8對I型膠原和 II 型膠原有很強(qiáng)的降解作用。MMP8通過調(diào)節(jié)纖調(diào)蛋白（整合素）的降解調(diào)節(jié)TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。MMP8抑制造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞遷移及粘附于成骨細(xì)胞[29]。

據(jù)研究I型膠原al鏈基因?qū)ψ兓膽?yīng)力刺激非常敏感，新生的成骨細(xì)胞敏感度高[25]，如沖擊波誘導(dǎo)新骨形成時(shí)成骨細(xì)胞中Col1a1表達(dá)增加 [26]。當(dāng)受到BMP-2和機(jī)械負(fù)荷刺激時(shí)成骨細(xì)胞提高Col1a1表達(dá)[27-28]，并釋放PGE2以響應(yīng)機(jī)械負(fù)載。適度的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可以促進(jìn)骨膠原形成，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則可使膠原纖維出現(xiàn)斷裂。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后24 h我們檢測到PBMCs中Col1a1的mRNA表達(dá)增加，這與已有報(bào)到一致[27-28]。Mmp8的表達(dá)受應(yīng)力刺激的影響。體外實(shí)驗(yàn)表明周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞中Mmp8表達(dá)增強(qiáng) [30]。在我們的運(yùn)動(dòng)模型中，與對照組相比，運(yùn)動(dòng)后24 h大鼠PBMCs中Mmp8的mRNA表達(dá)下降，而同時(shí)Col1a1表達(dá)升高，提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練24 h后，成骨作用增強(qiáng)，這也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。同時(shí)我們還檢測到Hes1和Gpnmb基因的mRNA表達(dá)增加，表明骨轉(zhuǎn)換增加，且機(jī)體內(nèi)環(huán)境有利于骨形成。這與已有對運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后骨微結(jié)構(gòu)的變化報(bào)道相符[12-13]。目前對應(yīng)力刺激下骨組織和PBMCS中Hes1和Gpnmb表達(dá)的變化尚未見報(bào)道。

3.2.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后Mitf、Smad7和Klf4基因表達(dá)水平的變化

MITF可能是破骨細(xì)胞功能和骨吸收的主要調(diào)節(jié)劑[6]，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞晚期分化。TGF-β增強(qiáng)RANKL誘導(dǎo)的Mitf表達(dá)的水平。Mitf通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞吸收功能至關(guān)重要的基因（如Trap，組織蛋白酶K和Ostm1等）的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。SMAD7是TGF-β家族通用抑制劑。抑制SMAD7的表達(dá)可通過經(jīng)典和非經(jīng)典途徑促進(jìn)骨形成[31]。但也有研究證明小鼠中SMAD7功能的部分喪失導(dǎo)致骨形成受損，骨吸收增強(qiáng)，故SMAD7被認(rèn)為是成骨和破骨細(xì)胞發(fā)生之間的新型關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[32]。KLF4抑制成骨細(xì)胞礦化，并在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)成骨基因的表達(dá)。成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了KLF4的小鼠其破骨細(xì)胞成熟顯示嚴(yán)重的缺陷。野生型骨髓衍生巨噬細(xì)胞與表達(dá)KLF4的成骨細(xì)胞共培養(yǎng)表現(xiàn)出多核破骨細(xì)胞形成的減少。KLF4過度表達(dá)下調(diào)了成骨細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞外基質(zhì)分子，干擾了細(xì)胞-基質(zhì)相互作用進(jìn)而影響到破骨細(xì)胞成熟[9]。有研究表明，新鮮骨折愈合過程中，KLF4蛋白與Smad7啟動(dòng)子相互作用。在原發(fā)性肝癌中KLF4可通過誘導(dǎo)Smad7啟動(dòng)子活性，激活Smad7轉(zhuǎn)錄來抑制致癌性TGF-β信號[8]。

在本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)后24 h Mitf的mRNA表達(dá)沒有發(fā)生顯著性變化。Mitf不僅受到TGF-β信號的調(diào)節(jié)，它也是肌腱膜纖維肉瘤癌基因B型（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein B，Mafb）（表達(dá)變化2.11倍，未發(fā)表）調(diào)控的靶基因，受到Mafb的負(fù)調(diào)控。MAFB是破骨細(xì)胞分化的主要負(fù)調(diào)節(jié)物，獨(dú)立于TGF-β在骨發(fā)育中獨(dú)立起作用[33]。在由RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分列的過程中，Mafb表達(dá)水平下降。Mafb表達(dá)增加增強(qiáng)了對Mitf表達(dá)的負(fù)調(diào)控，骨重塑狀態(tài)趨向于以成骨為主，這也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。Mitf表達(dá)是否對機(jī)械應(yīng)力刺激敏感目前尚未見報(bào)道。

Smad7的表達(dá)對機(jī)械應(yīng)力刺激敏感。據(jù)研究Smad7在牽張成骨早期及骨組織破壞最嚴(yán)重的部位表達(dá)最高，并高于正常組織，到中晚期Smad7表達(dá)下降，其表達(dá)量與骨愈合部位骨密度成反比。但也有學(xué)者認(rèn)為，Smad7在早期實(shí)際含量較基礎(chǔ)水平減少，隨后含量又不斷回升至正常水平[34]。創(chuàng)傷后瘢痕愈合中組織中Smad7較正常皮膚組織含量低，但壓應(yīng)力治療時(shí)Smad7表達(dá)上調(diào)。Klf4是不同機(jī)械剪應(yīng)力的機(jī)械生物信號感受器。在層流剪切應(yīng)力刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到許多Klf的表達(dá)。 其中Klf4表達(dá)增加倍數(shù)最高，并顯示層流剪切應(yīng)力依賴性增加[35]。在血管平滑肌細(xì)胞中的研究表明機(jī)械拉伸改變Klf4蛋白表達(dá)[36]。在本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后運(yùn)動(dòng)組Smad7和Klf4表達(dá)較對照組略有上升趨勢，但均未發(fā)生顯著性變化，故二者對成骨的抑制作用不明顯，也有利于骨形成，也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。關(guān)于水平跑臺(tái)應(yīng)力刺激后不同時(shí)間內(nèi)Smad7和Klf4表達(dá)變化趨勢有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 跑臺(tái)訓(xùn)練后PBMCs中TGF-β/BMPs信號途徑相關(guān)的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表達(dá)與本實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)利于骨質(zhì)改善相符，且與骨密度及骨形態(tài)等指標(biāo)比較，能夠更靈敏反映運(yùn)動(dòng)對骨重塑的影響。提示上述基因有望成為反映運(yùn)動(dòng)對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記，但尚需進(jìn)一步研究。

4.2 本研究對運(yùn)動(dòng)后PBMCs中TGF-β/BMPs信號途徑相關(guān)的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達(dá)與骨重塑的關(guān)系進(jìn)行首次報(bào)道，也為PBMCs作為研究運(yùn)動(dòng)影響骨重塑的組織取材提供TGF-β/BMPs信號途徑的分子生物學(xué)依據(jù)，為研究運(yùn)動(dòng)后不同信號對骨重塑的調(diào)節(jié)提供參考資料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Singh M， Del Carpio-Cano FE， Monroy MA， et al. Homeodomain transcription factors regulate BMP-2-induced osteoactivin transcription in osteoblasts[J]. J Cell Physiol，2012，227（1）：390-399.

[2]Nyhan KC， Faherty N， Murray G， et al. Jagged/Notch signalling is required for a subset of TGF-β1 responses in human kidney epithelial cells[J]. Biochim Biophys Acta，2010，1803（12）：1386-1395.

[3]Abdelmagid SM， Belcher JY， Moussa FM， et al.Mutation in Osteoactivin Decreases Bone Formation in Vivo and Osteoblast Differentiation in Vitro[J]. Am J Patho， 2014，184（3）：697-713.

[4]Hsieh YP， Chen HM， Lin HY，et al.Epigallocatechin-3-gallate inhibits transforming-growth-factor-β1-induced collagen synthesis by suppressing early growth response-1 in human buccal mucosal fibroblasts[J]. J Formos Med Assoc，2017，116（2）：107-113.

[5]Wen G， Zhang C， Chen Q， et al.A Novel Role of Matrix Metalloproteinase-8 in Macrophage Differentiation and Polarization [J]. J Biol Chem，2015， 290（31）：19158-19172.

[6]Asai K， Funaba M， Murakami M. Enhancement of RANKL-induced MITF-E expression and osteoclastogenesis by TGF-β[J]. Cell Biochem Funct.2014，32（5）：401-409.

[7]Nakao A， Afrakhte M，Morén A， et al.Identification of Smad7， a TGFbeta-inducible antagonist of TGF-beta signalling[J].Nature，1997，389（6651）：631-635.

[8]Sun H， Peng Z， Tang H， et al.Loss of KLF4 and consequential downregulation of Smad7 exacerbate oncogenic TGF-β signaling in and promote progression of hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene，2017.

[9]Fujikawa J， Tanaka M， Itoh S，et al.Kruppel-like factor 4 expression in osteoblasts represses osteoblast-dependent osteoclast maturation[J]. Cell Tissue Res，2014，358（1）：177-187.

[10]Bernard-Poenaru O， Roux C， Blanqué R， et al.Bone-resorbing cytokines from peripheral blood mononuclear cells after hormone replacement therapy：alongitudinal study[J]. Osteoporos Int，2001，12（9）：769-776.

[11]Eghbali-Fatourechi GZ， Lamsam J， Fraser D， et al.Circulating osteoblast-lineage Cells in humans[J]. N Engl J Med，2005，352（19）：1959-1966.

[12]楊永杰，高麗，章嵐，等.運(yùn)動(dòng)對生長期大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中wnt途徑相關(guān)骨重塑基因的影響[J]. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2016， 35（11）：1015-1021.

[13]Ju YI， Sone T， Ohnaru K， et al. Differential effects of jump versus running exercise on trabecular architecture during remobilization after suspension-induced osteopenia in growing rats[J]. J ApplPhysiol， 2012， 112（5）：766-772.

[14]Chen G，Deng C，Li YP.TGF‐β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation[J].Int J Biol Sci， 2012，8（2）：272-288.

[15]Rahman MS， Akhtar N， Jamil HM， et al.TGF-β/BMP signaling and other molecular events：regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Bone Res，2015， 3：15005（1-20）.

[16]Lin GL，Hankenson KD. Integration of BMP， Wnt， and notch signaling pathways inosteoblast differentiation[J].J Cell Biochem， 2011，112（12）：3491-5301.

[17]Jung HS， Hyun WL， Joo-Won L， et al. Hes1 stimulates transcriptional activity of Runx2 by increasing protein stabilization during osteoblast differentiation[J].Biochem Biophys Res Commum，2008， 367（1）：97–102.

[18]Bai S， Kopan R， Zou W， et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells[J]. J Biol hem，2008，283（10）：6509 -6518.

[19]Abdelmagid SM， Barbe MF， Hadjiargyrou M， et al. Temporal and spatial expression of osteoactivin during fracture repair[J].J Cell Biochem，2010， 111（2）：295-309.

[20]Watanabe Y， Namba A， Aida Y， et al. IL-1beta suppresses the formation of osteoclasts by increasing OPG production via an autocrine mechanism involving celecoxib-related prostaglandins in chondrocytes[J]. Mediators Inflamm，2009， 2009：308596（1-9）.

[21]Abdelmagid SM， Sondag GR， Moussa FM， et al. Mutation in Osteoactivin Promotes RANKL-Mediated Osteoclast Differentiation and Survival， but Inhibits Osteoclast Function[J]. J BiolChem， 2015，290（33）：20128-20146.

[22]Sheng MH， Wergedal JE， Mohan S， et al. Osteoactivin is a novel osteoclastic protein and plays a key role in osteoclast differentiation and activity[J]. FEBS Lett， 2008，582（10）：1451-1458.

[23]Komori T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2[J]. Cell Tissue Res，2010，339（1）：189-195.

[24]Lu C， Wan Y， Cao J， et al. Wnt-mediated reciprocal regulation between cartilage and bone development during endochondral ossification[J]. Bone， 2013， 53（2）：566-574.

[25]Christian A， Anne CA， Caillot A， et al. Bone formation and resorption biological markers in cosmonauts during and after a 180-day space flight（Euromir 95）[J].Clin Chem，1998， 44（3）：578-585.

[26]Takahashi K， Yamazaki M， Saisu T， et al.Gene expression for extracellular matrix proteins in shockwave-induced osteogenesis in rats[J]. Calcif Tissue Int，2004，74（2）：187-193.

[27]黃林劍，李輝，謝千陽，等. 靜壓力下兔髁突軟骨細(xì)胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表達(dá)變化[J]. 中國口腔頜面外科雜志，2014，12（4）：295-300.

[28]Vazquez M， Evans BA， Riccardi D， et al. A new method to investigate how mechanical loading of osteocytes controls osteoblasts[J]. Front Endocrinol （Lausanne），2014 ，5：208（1-18）.

[29]Steinl C， Essl M， Schreiber TD， et al.release of matrix metalloproteinase-8 during physiological trafficking and induced mobilization of humanhematopoietic stem cells[J]. Stem Cells Dev， 2013， 22（9）：1307-1318.

[30]華先明，李雪，韓光麗，等.周期性張應(yīng)力對牙周膜細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-8和13表達(dá)的影響[J].中國組織工程研究，2012，28（11）：1126-1129.

[31]Layliev J， Sagebin F， Weinstein A，et al. Percutaneous gene therapy heals cranial defects[J]. Gene Ther， 2013，20（9）：922-929.

[32]Li N， Lee WY， Lin SE，et al.Partial loss of Smad7 function impairs bone remodeling， osteogenesis and enhances osteoclastogenesis in mice[J]. Bone， 2014，67：46-55.

[33]Omoteyama K， IkedaH，Imaki J， Sakai M. Activation of connective tissue growth factor gene by the c-Maf and Lc-Maf transcription factors[J]. Biochem Biophys Res Commun，2006，339（4）：1089-1097.

[34]莘曉陶， 李曦光， 畢賢峰，等.Smad7在兔下頜骨牽張成骨過程中的表達(dá)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2010， 14（20）：3633-3636.

[35]Mun GI， Boo YC.A regulatory role of Kruppel-like factor 4 in endothelial argininosuccinate synthetase 1 expression in response to laminar shear stress[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，420（2）：450-455.

[36]Hu B， Song JT， Qu HY， et al.Mechanical stretch suppresses microRNA-145 expression by activating extracellular signal-regulated kinase 1/2 and upregulating angiotensin-converting enzyme to alter vascular smooth muscle cell phenotype[J]. PLoS One，2014 ，9（5）：e96338.