陳 銳，丁國芳,,*，楊最素，余方苗，黃芳芳，唐云平，張小軍，陳 思，梅光明

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

目前，各種食物來源的活性肽已被報(bào)道具有抗腫瘤[1-2]、抗凝血和抗血栓[3-4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗高血壓[7]等作用。因此，食用含有生物活性肽的功能性食品成為人們預(yù)防疾病和對(duì)疾病的輔助性治療的一種新型策略。鱈魚（Melanogrammus aeglefinus）屬于鱈形目鱈魚科黑線鱈屬，是底層冷水性群聚魚類，我國鱈魚年加工量40萬～50萬 t，魚皮作為下腳料，占加工量的8%左右。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鱈魚皮中的活性肽在抗氧化、降血壓和抗胃潰瘍等方面表現(xiàn)出顯著的功效[8-10]。鱈魚皮中的蛋白主要為膠原蛋白，其含量最高可達(dá)到80%[11]，因膠原蛋白和膠原蛋白肽具有廣泛的生物活性，目前已被用作保健食品。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，鱈魚皮膠原蛋白肽（cod skin collagen peptide，CSCP）具有較好的抗氧化活性，能夠作用于經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后損傷的正常肝Chang liver細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力顯著升高、上清液中轉(zhuǎn)氨酶活力下降，降低細(xì)胞早期凋亡率，對(duì)肝細(xì)胞損傷具有一定的修復(fù)能力；其對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠慢性和急性肝損傷也具有一定的預(yù)防和保護(hù)作用[12-13]。CSCP在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的生物活性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明完整的CSCP對(duì)肝細(xì)胞具有修復(fù)作用。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CSCP經(jīng)灌胃方式給藥的體內(nèi)消化吸收過程較為復(fù)雜，其在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制尚不明確。因此，闡明CSCP在胃腸道的穩(wěn)定性對(duì)于研究其在腸道中的吸收機(jī)制具有重要意義。Caco-2細(xì)胞單層模型是目前最成熟也是應(yīng)用最多的體外吸收模型，廣泛用于研究口服藥物、肽類等營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的吸收機(jī)制[14-15]。為了有效地開發(fā)利用CSCP，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)其在胃腸道中的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用Caco-2細(xì)胞模型研究CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性，從細(xì)胞水平探究其在腸道的吸收機(jī)制，為深入研究CSCP的口服吸收機(jī)制及藥物代謝動(dòng)力學(xué)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Caco-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心代培養(yǎng)。CSCP由浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心自制，分子質(zhì)量為7 700 Da，N端前20 個(gè)氨基酸序列為：GEMGPAGAKGAQGKTGPVGE。

鱈魚皮 大連鴻運(yùn)海產(chǎn)品加工廠；MEM（minimum Eagle’s medium）粉末培養(yǎng)基、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒日本同仁公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、三氟乙酸、維拉帕米、MK-571、氧化苯砷、去氧膽酸鈉 美國Sigma公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；Transwell培養(yǎng)板（聚碳酸酯膜直徑24 mm，孔徑0.4 μm，膜面積4.5 cm2） 美國Corning公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma3111型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientif i c公司；多功能酶標(biāo)儀 美國美谷分子儀器有限公司；倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS公司；Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀 美國Millipore公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；透射電子顯微鏡 日本日立儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法測(cè)定CSCP含量

色譜條件：Z O R B A X S B-C18分析型色譜柱（9.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長220 nm；流速2 mL/min；流動(dòng)相A為超純水（含體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸溶液），流動(dòng)相B為乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸溶液），采用等度洗脫方式，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為85∶15；柱溫25 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL。以CSCP的峰面積對(duì)鱈魚皮膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸得到回歸方程進(jìn)行定量。

1.3.2 CSCP在胃腸道穩(wěn)定性的測(cè)定

1.3.2.1 CSCP在接近胃腸道環(huán)境的不同pH值中的穩(wěn)定性

按戎曉娟等[16]的方法稍作修改。取0.9 mL不同pH值（1.2、2.5、5.0、6.5、7.4～8.0）的磷酸鹽緩沖液，分別加入0.1 mL 10 mg/mL CSCP溶液，置于37 ℃水浴中，分別于0、10、30、60、120、180 min時(shí)取樣，100 ℃滅酶15 min，利用HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定CSCP質(zhì)量濃度，CSCP最終質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度的比值即為剩余百分率。

1.3.2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性

將CSCP加入人工胃液和人工腸液中，使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL，漩渦振蕩2 s，并于37 ℃孵育，分別于0、10、30、60、120、180 min時(shí)取樣，100 ℃滅酶15 min，利用HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定CSCP質(zhì)量濃度，CSCP最終質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度的比值即為剩余百分率。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞在MEM培養(yǎng)液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每天換液，待細(xì)胞長至80%以上時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞為25～35 代。

1.3.4 CSCP細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

使用CCK-8試劑盒檢測(cè)給予不同質(zhì)量濃度CSCP后Caco-2細(xì)胞的存活率。將Caco-2細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液。將Caco-2細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組（只加MEM培養(yǎng)液）和藥物組（CSCP質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL），空白孔不接種細(xì)胞，加入等量磷酸鹽緩沖液。在培養(yǎng)箱中孵育6 h后，吸去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μL，然后向每孔加10 μL CCK-8，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處OD值。按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：OD1為藥物組OD值；OD2為空白對(duì)照組OD值；OD3為空白孔OD值。

1.3.5 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立與評(píng)價(jià)

1.3.5.1 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立

取Caco-2細(xì)胞制成密度為1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，先加入2 mL新鮮培養(yǎng)基于Transwell 6 孔板板底側(cè)（basolateral side，BL），再加入2 mL細(xì)胞懸液于6 孔板頂側(cè)（apical side，AP），接種后隔天換液，一周后每天換液?？瞻卓撞唤臃N細(xì)胞，加入等量磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)至21 d，將細(xì)胞單層連同聚碳酸酯膜一同取下，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞分化情況。

1.3.5.2 TEER的測(cè)定

用Millicell-ERS電阻儀測(cè)定各孔電阻值，細(xì)胞單層的跨膜電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）按照公式（2）計(jì)算。

式中：Rt為細(xì)胞孔電阻值/Ω；R0為空白孔電阻值/Ω；A為Transwell小室有效膜面積/cm2。

1.3.5.3 ALP活力的測(cè)定

ALP是Caco-2細(xì)胞刷狀緣的標(biāo)志性酶，可以根據(jù)此酶的活力來分析腸上皮細(xì)胞的分化程度。使用ALP試劑盒分別測(cè)定Caco-2細(xì)胞內(nèi)、6 孔板AP側(cè)和BL側(cè)的ALP活力。Caco-2細(xì)胞單層生長至7、14、21 d時(shí)，吸干小室內(nèi)、外培養(yǎng)液，刮取細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞使之釋放出ALP，按試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞內(nèi)ALP活力。

1.3.6 CSCP的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 CSCP在Caco-2細(xì)胞單層的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)

取出已建立好的Caco-2細(xì)胞單層模型，吸干內(nèi)、外側(cè)培養(yǎng)液，培養(yǎng)小室內(nèi)、外側(cè)各加入2 mL 37 ℃的HBSS（Hank’s balanced salt solution），漂洗3 次，清除細(xì)胞表面干擾物質(zhì)。內(nèi)側(cè)加入2.5 mL HBSS，外側(cè)加入3.0 mL HBSS，在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min。按1.3.5.2節(jié)方法計(jì)算TEER值，選擇TEER大于400 Ω·cm2的細(xì)胞單層吸干HBSS繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于從AP向BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在AP側(cè)加入2.0 mL質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液（溶解于HBSS）作為供給池，BL側(cè)加入2.5 mL HBSS作為接收池。對(duì)于從BL向AL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在BL側(cè)加入2.5 mL質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液（溶解于HBSS）作為供給池，AP側(cè)加入2.0 mL HBSS作為接收池。加樣后立即將Transwell板置于恒溫?fù)u床中孵育（37 ℃、40 r/min），于0、30、60、90、120、150、180 min時(shí)分別在接收池取樣150 μL，利用HPLC測(cè)定CSCP質(zhì)量濃度。從AP向BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，不同時(shí)間點(diǎn)BL側(cè)吸收的藥量（累積轉(zhuǎn)運(yùn)量）以QrBi表示；從BL向AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，不同時(shí)間點(diǎn)AP側(cè)室吸收的藥量（累積轉(zhuǎn)運(yùn)量）以QrAi表示，分別按式（3）、（4）計(jì)算[17]。

式中：0.15為取樣體積/mL；2.5和2.0分別為接收池BL側(cè)和AP側(cè)緩沖液的總體積/mL；ρri為接收池第i個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)際質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6.2 質(zhì)量濃度對(duì)CSCP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

細(xì)胞單層的前處理同1.3.6.1節(jié)方法，在AP側(cè)分別加入2.0 mL質(zhì)量濃度為為0.02、0.04、0.08、0.10、0.25 mg/mL的CSCP溶液，隨后的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)同1.3.6.1節(jié)方法。180 min內(nèi)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量的計(jì)算如公式（3）。

1.3.6.3 不同藥物對(duì)CSCP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

為了探究CSCP在Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)中的吸收途徑及是否受到某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)，進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。細(xì)胞單層的前處理同1.3.6.1節(jié)方法，隨后在AP側(cè)分別加入2.0 mL含有維拉帕米（100 μmol/L）、MK-571（50 μmol/L）、氧化苯砷（25 mmol/L）、去氧膽酸鈉（100 mmol/L）和不加藥物（空白對(duì)照組）的CSCP溶液（0.25 mg/mL），BL側(cè)加入2.5 mL HBSS，隨后的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)同1.3.6.1節(jié)方法。其中，維拉帕米和氧化苯砷溶解于含體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的HBSS中，MK-571和去氧膽酸鈉溶解于不含DMSO的HBSS中。180 min內(nèi)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量的計(jì)算如公式（3）。CSCP透過Caco-2細(xì)胞單層的表觀滲透系數(shù)Papp按式（5）計(jì)算[18]。

式中：ΔQ為時(shí)間Δt/s內(nèi)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量/mg；A為聚碳酸脂膜的面積（4.5 cm2）；ρ0為CSCP初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

外排比率（efflux ratio，ER）用Papp（B-A）（從BL向AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)）與Papp（A-B）（從AP向BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)）的比值表示[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CSCP在不同pH值中的穩(wěn)定性分析

圖 1 CSCP在不同pH值溶液中的穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 1 Stability of CSCP under different pH conditions

如圖1所示，經(jīng)HPLC分析可得，CSCP在接近胃腸道環(huán)境的各pH值中基本保持穩(wěn)定，在180 min內(nèi)降解緩慢，180 min時(shí)仍有90%以上保持原型。

2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性分析

圖 2 CSCP在人工胃液（A）和人工腸液（B）中的穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 2 Stability of CSCP in artif i cial gastric juice (A) and artif i cial intestinal juice (B)

如圖2所示，在前10 min內(nèi)，CSCP在人工胃液（圖2A）和人工腸液（圖2B）內(nèi)均降解了6%左右；10 min后CSCP在兩種溶液中均降解緩慢；180 min后，在人工胃液和人工腸液中最終分別剩余94.02%和94.46%。人工胃液和人工腸液對(duì)CSCP穩(wěn)定性的影響并不大，可能是胃蛋白酶的水解位點(diǎn)為色氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸的氨基端，而Edman自動(dòng)降解法測(cè)得CSCP的氨基端為甘氨酸；而且CSCP是由鱈魚皮膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到，所以腸液中的胰蛋白酶對(duì)CSCP幾乎沒有影響，該結(jié)果與接近腸道pH值時(shí)的穩(wěn)定性基本一致。

2.3 不同質(zhì)量濃度CSCP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

表 1 不同質(zhì)量濃度CSCP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of CSCP at various concentrations on Caco-2 cell viability

CCK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（表1）表明，隨著CSCP質(zhì)量濃度的增加，Caco-2細(xì)胞存活率逐漸降低。在CSCP質(zhì)量濃度為0.10、0.25 mg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞的存活率大于90%，在質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低，達(dá)到77.31%，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。而且，轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)在3 h內(nèi)完成，遠(yuǎn)少于CCK-8實(shí)驗(yàn)的6 h。因此，選取細(xì)胞存活率大于90%時(shí)CSCP的質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，0.25 mg/mL為最高轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)量濃度。

2.4 Caco-2細(xì)胞單層模型的驗(yàn)證結(jié)果

在6 孔板上培養(yǎng)21 d后，倒置顯微鏡下觀察到Caco-2細(xì)胞連接緊密，邊界清晰，形成了一層致密的細(xì)胞單層（圖3）。透射電子顯微鏡觀察聚碳酸酯膜上的Caco-2細(xì)胞單層（圖4），發(fā)現(xiàn)其微絨毛形成的刷狀緣整齊致密，細(xì)胞間形成緊密連接和橋粒，說明Caco-2細(xì)胞已出現(xiàn)極化，呈不對(duì)稱分布，具有小腸上皮細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)特征。

圖 3 倒置顯微鏡下Caco-2細(xì)胞單層上皮表面觀察結(jié)果（×200）Fig. 3 Epithelium monolayer surface under an inverted microscope (× 200)

圖 4 透射電子顯微鏡下Caco-2細(xì)胞側(cè)面連接觀察結(jié)果（×40 000）Fig. 4 Caco-2 cell connection under an transmission electron microscope (× 40 000)

2.5 Caco-2細(xì)胞單層模型的評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.1 Caco-2細(xì)胞單層TEER值分析

本實(shí)驗(yàn)中C a c o-2細(xì)胞單層T E E R值在（580.2±36.1）Ω·cm2之間變動(dòng)。細(xì)胞TEER值超過400 Ω·cm2才能用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，得到可靠的結(jié)果[20]，表明本實(shí)驗(yàn)條件下，Caco-2細(xì)胞成膜情況較好，致密性優(yōu)良，可以用于CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 Caco-2生長過程中ALP活力的變化

表 2 Caco-2細(xì)胞單層ALP活力變化Table 2 Change in ALP activity of Caco-2 cell monolayer

由表2可見，細(xì)胞內(nèi)ALP活力隨著時(shí)間的延長迅速增加，14 d以后增長趨勢(shì)稍緩，到第21天ALP活力比第7天增加了4 倍左右，說明Caco-2細(xì)胞逐漸分化成熟，AP側(cè)與BL側(cè)ALP活力比值的升高證明ALP的分布極不對(duì)稱，細(xì)胞出現(xiàn)了非常明顯的極化現(xiàn)象。

2.6 CSCP在Caco-2細(xì)胞單層的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)分析

圖 5 時(shí)間對(duì)CSCP跨Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 5 Time-course curves of CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

如圖5所示，初始質(zhì)量濃度一定時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間的延長而增加，尤其是AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)在1 h后呈近似線性增加，且3 h內(nèi)未見飽和；而BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量在前2 h基本為0，2 h后緩慢增加。結(jié)果表明CSCP在Caco-2細(xì)胞單層的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)均存在明顯的時(shí)間依賴性，且在60～150 min時(shí)，AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率遠(yuǎn)大于反向轉(zhuǎn)運(yùn)速率，AP側(cè)到BL側(cè)3 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)量也明顯高于BL側(cè)到AP側(cè)，提示CSCP的轉(zhuǎn)運(yùn)具有方向性，且受到某種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排作用，從累積轉(zhuǎn)運(yùn)量來看，Caco-2細(xì)胞單層對(duì)CSCP的吸收作用大于外排作用。

2.7 質(zhì)量濃度對(duì)CSCP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響分析

圖 6 質(zhì)量濃度對(duì)CSCP跨Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 6 Concentration-dependent CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

由圖6可以發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)運(yùn)的3 h內(nèi)，CSCP的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量隨質(zhì)量濃度的升高而增加，說明CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是濃度依賴型，且在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)沒有達(dá)到飽和，提示CSCP在Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。

2.8 藥物種類對(duì)CSCP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

圖 7 藥物種類對(duì)CSCP轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig. 7 Effects of drugs on CSCP transport

多肽和蛋白質(zhì)藥物的口服吸收途徑主要包括載體轉(zhuǎn)運(yùn)、胞飲作用和細(xì)胞旁路途徑[21]。如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，去氧膽酸鈉明顯增強(qiáng)了CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（P＜0.01），去氧膽酸鈉是旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑，能打開細(xì)胞間的緊密連接[22]，表明CSCP的主要跨膜機(jī)制是細(xì)胞旁路途徑；MK-571為多藥耐藥蛋白抑制劑[23]，也增加了CSCP的轉(zhuǎn)運(yùn)，且與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；維拉帕米（P-糖蛋白抑制）和氧化苯砷（內(nèi)吞抑制劑）對(duì)CSCP的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有顯著影響，表明在CSCP的吸收過程中，內(nèi)吞不是主要機(jī)制，多藥耐藥蛋白介導(dǎo)了CSCP的外排。不同轉(zhuǎn)運(yùn)條件下的Papp見表3。

由表3可知，比較Papp發(fā)現(xiàn)，Papp（B-A）/Papp（A-B）值小于1，即ER值小于1，提示CSCP的轉(zhuǎn)運(yùn)具有方向性，攝取作用大于外排作用。加入去氧膽酸鈉后，Papp增加為空白對(duì)照的4 倍左右，差異極顯著（P＜0.01）；加入MK-571后Papp也有所增加，約為空白對(duì)照組的1.4 倍，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其余藥物對(duì)Papp沒有顯著影響。

3 討 論

多年來人們一直認(rèn)為蛋白質(zhì)口服后，大多數(shù)在體內(nèi)酶的作用下被完全水解為氨基酸再吸收入血[24]。近年來，一些以蛋白質(zhì)為主的藥物口服后可經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，口服重組水蛭素-2可部分以其原型活性形式被吸收入血并產(chǎn)生抗凝作用，回腸是其最佳吸收部位[25-26]。張倩等[27]發(fā)現(xiàn)鹿茸中分子質(zhì)量小于45 kDa的蛋白可以透過腸壁吸收，口服給予大鼠異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鹿茸蛋白，在血清中能檢測(cè)到熒光蛋白。關(guān)于胰島素的研究表明，胰島素在腸道引入后，被上皮細(xì)胞吸收并進(jìn)入血液循環(huán)起到降低血糖作用，通過組織切片的免疫化學(xué)顯示，胰島素以內(nèi)吞的形式被吸收[28]。大量研究表明一些具有生理活性的多肽和蛋白質(zhì)可以被腸道上皮細(xì)胞吸收而進(jìn)入血液循環(huán)，但生物利用度并不高。為了提高其生物利用度、開發(fā)蛋白質(zhì)和多肽類藥物的口服制劑，一些新的劑型和給藥方法成為研究熱點(diǎn)，目前主要有結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)、脂質(zhì)體載體和微乳載藥等[21]。

口服是最方便也是最容易讓人接受的給藥途徑，但有些藥物因在胃腸道不穩(wěn)定、生物利用度低等原因而不能制成口服劑型。因此，在設(shè)計(jì)、優(yōu)化、選擇口服藥物時(shí)，預(yù)測(cè)其腸道吸收是主要考慮因素之一。用于評(píng)估藥物吸收的一系列臨床前方法包括計(jì)算機(jī)、體內(nèi)、體外、在體和離體等方法[29]。然而，當(dāng)今社會(huì)和科學(xué)對(duì)動(dòng)物的關(guān)愛以及制藥行業(yè)對(duì)快速、經(jīng)濟(jì)和可靠模型的需求，使得人們極其迫切地尋求和建立與體內(nèi)吸收具有良好相關(guān)性的模型。Caco-2細(xì)胞模型法最早由Hidalgo等[30]在1989年提出，一旦匯合成完整細(xì)胞單層，Caco-2細(xì)胞就會(huì)分化成在結(jié)構(gòu)和功能上與成熟小腸細(xì)胞類似的細(xì)胞。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，典型的微絨毛、一些分子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、代謝酶和細(xì)胞間的緊密連接都能表達(dá)[31]。而且Caco-2細(xì)胞來源于人，同源性較好，實(shí)驗(yàn)條件易受控制?；谝陨咸卣?，Caco-2細(xì)胞模型能從細(xì)胞水平評(píng)估藥物的黏膜滲透率，從而闡明藥物的腸吸收機(jī)制。

目前，膠原蛋白肽的保健功能主要在抗氧化、美容護(hù)膚、止血和免疫等方面[32]，還鮮有關(guān)于膠原蛋白肽對(duì)肝損傷保護(hù)作用的研究。現(xiàn)有的肝病治療主要依靠化學(xué)藥物，但化學(xué)藥物都具有一定的毒性。CSCP是本課題組從水產(chǎn)加工副產(chǎn)物鱈魚皮中提取獲得的膠原蛋白肽，其具有良好的護(hù)肝活性[12-13]，無毒且安全，是理想的輔助治療保健品。為有效地開發(fā)利用CSCP，本研究建立了Caco-2細(xì)胞單層模型并研究CSCP跨腸細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，評(píng)估CSCP的黏膜滲透率，探究CSCP的跨膜吸收機(jī)制。在進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)前，首先對(duì)CSCP的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇細(xì)胞存活率大于90%的質(zhì)量濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)量濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞有毒性，則轉(zhuǎn)運(yùn)過程中TEER值可能下降到低于標(biāo)準(zhǔn)值，細(xì)胞間緊密連接變松散，計(jì)算得到的轉(zhuǎn)運(yùn)量和Papp會(huì)比實(shí)際值偏大。實(shí)驗(yàn)表明CSCP跨Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)受到多種因素的影響，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，Papp也隨時(shí)間的延長逐漸增大?；衔锏腜app與人體內(nèi)的吸收率具有良好的相關(guān)性，Papp為1×10-6～10×10-6cm/s，表明體內(nèi)吸收適中，相當(dāng)于給藥劑量的20%～70%[33]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得CSCP的Papp為（8.51±0.27）×10-6cm/s，說明CSCP吸收良好。由于Caco-2細(xì)胞單層的緊密連接比人和動(dòng)物小腸的更緊密一些[31]，通過細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物在Caco-2細(xì)胞模型中的滲透率比體內(nèi)吸收稍低。

4 結(jié) 論

CSCP在模擬胃腸道環(huán)境中較為穩(wěn)定，其跨Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制為細(xì)胞旁路途徑，其外排受到多藥耐藥蛋白的介導(dǎo)；CSCP的Papp為（8.51±0.27）×10-6cm/s，說明其在體內(nèi)吸收適中。本研究從細(xì)胞水平探究了CSCP在腸道中的吸收機(jī)制，為深入研究CSCP的口服吸收機(jī)制及藥物代謝動(dòng)力學(xué)提供依據(jù)。