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        鱈魚皮膠原蛋白肽在Caco-2細胞單層模型中的吸收機制

        2018-10-29 02:39:12丁國芳楊最素余方苗黃芳芳唐云平張小軍梅光明
        食品科學 2018年19期
        關(guān)鍵詞:單層濃度細胞

        陳 銳,丁國芳,,*,楊最素,余方苗,黃芳芳,唐云平,張小軍,陳 思,梅光明

        (1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點工程技術(shù)研究中心,浙江 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江 舟山 316021)

        目前,各種食物來源的活性肽已被報道具有抗腫瘤[1-2]、抗凝血和抗血栓[3-4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗高血壓[7]等作用。因此,食用含有生物活性肽的功能性食品成為人們預(yù)防疾病和對疾病的輔助性治療的一種新型策略。鱈魚(Melanogrammus aeglefinus)屬于鱈形目鱈魚科黑線鱈屬,是底層冷水性群聚魚類,我國鱈魚年加工量40萬~50萬 t,魚皮作為下腳料,占加工量的8%左右。近年來的研究發(fā)現(xiàn),鱈魚皮中的活性肽在抗氧化、降血壓和抗胃潰瘍等方面表現(xiàn)出顯著的功效[8-10]。鱈魚皮中的蛋白主要為膠原蛋白,其含量最高可達到80%[11],因膠原蛋白和膠原蛋白肽具有廣泛的生物活性,目前已被用作保健食品。本實驗室前期研究表明,鱈魚皮膠原蛋白肽(cod skin collagen peptide,CSCP)具有較好的抗氧化活性,能夠作用于經(jīng)脂多糖誘導后損傷的正常肝Chang liver細胞,使細胞內(nèi)抗氧化酶活力顯著升高、上清液中轉(zhuǎn)氨酶活力下降,降低細胞早期凋亡率,對肝細胞損傷具有一定的修復(fù)能力;其對四氯化碳誘導的小鼠慢性和急性肝損傷也具有一定的預(yù)防和保護作用[12-13]。CSCP在細胞和動物實驗中均表現(xiàn)出良好的生物活性,細胞實驗表明完整的CSCP對肝細胞具有修復(fù)作用。然而,在動物實驗中,CSCP經(jīng)灌胃方式給藥的體內(nèi)消化吸收過程較為復(fù)雜,其在胃腸道的轉(zhuǎn)運吸收機制尚不明確。因此,闡明CSCP在胃腸道的穩(wěn)定性對于研究其在腸道中的吸收機制具有重要意義。Caco-2細胞單層模型是目前最成熟也是應(yīng)用最多的體外吸收模型,廣泛用于研究口服藥物、肽類等營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的吸收機制[14-15]。為了有效地開發(fā)利用CSCP,本實驗擬對其在胃腸道中的穩(wěn)定性進行評價,并使用Caco-2細胞模型研究CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運特性,從細胞水平探究其在腸道的吸收機制,為深入研究CSCP的口服吸收機制及藥物代謝動力學提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        Caco-2細胞株購于中國科學院細胞庫,由浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點工程技術(shù)研究中心代培養(yǎng)。CSCP由浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點工程技術(shù)研究中心自制,分子質(zhì)量為7 700 Da,N端前20 個氨基酸序列為:GEMGPAGAKGAQGKTGPVGE。

        鱈魚皮 大連鴻運海產(chǎn)品加工廠;MEM(minimum Eagle’s medium)粉末培養(yǎng)基、質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 美國Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司;CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒日本同仁公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、三氟乙酸、維拉帕米、MK-571、氧化苯砷、去氧膽酸鈉 美國Sigma公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒 南京建成生物工程研究所;乙腈、甲醇(均為色譜純) 德國Merck公司;Transwell培養(yǎng)板(聚碳酸酯膜直徑24 mm,孔徑0.4 μm,膜面積4.5 cm2) 美國Corning公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Forma3111型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientif i c公司;多功能酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司;倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS公司;Millicell ERS-2細胞電阻儀 美國Millipore公司;1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國Agilent公司;透射電子顯微鏡 日本日立儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 HPLC法測定CSCP含量

        色譜條件:Z O R B A X S B-C18分析型色譜柱(9.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長220 nm;流速2 mL/min;流動相A為超純水(含體積分數(shù)0.05%三氟乙酸溶液),流動相B為乙腈(含體積分數(shù)0.05%三氟乙酸溶液),采用等度洗脫方式,流動相A與流動相B的體積比為85∶15;柱溫25 ℃;自動進樣,進樣量20 μL。以CSCP的峰面積對鱈魚皮膠原蛋白標準溶液的質(zhì)量濃度進行線性回歸得到回歸方程進行定量。

        1.3.2 CSCP在胃腸道穩(wěn)定性的測定

        1.3.2.1 CSCP在接近胃腸道環(huán)境的不同pH值中的穩(wěn)定性

        按戎曉娟等[16]的方法稍作修改。取0.9 mL不同pH值(1.2、2.5、5.0、6.5、7.4~8.0)的磷酸鹽緩沖液,分別加入0.1 mL 10 mg/mL CSCP溶液,置于37 ℃水浴中,分別于0、10、30、60、120、180 min時取樣,100 ℃滅酶15 min,利用HPLC標準曲線測定CSCP質(zhì)量濃度,CSCP最終質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度的比值即為剩余百分率。

        1.3.2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性

        將CSCP加入人工胃液和人工腸液中,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,漩渦振蕩2 s,并于37 ℃孵育,分別于0、10、30、60、120、180 min時取樣,100 ℃滅酶15 min,利用HPLC標準曲線測定CSCP質(zhì)量濃度,CSCP最終質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度的比值即為剩余百分率。

        1.3.3 細胞培養(yǎng)

        Caco-2細胞在MEM培養(yǎng)液(含質(zhì)量分數(shù)20%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL)中進行培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育,每天換液,待細胞長至80%以上時用質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶溶液進行消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。本實驗所用的Caco-2細胞為25~35 代。

        1.3.4 CSCP細胞毒性實驗

        使用CCK-8試劑盒檢測給予不同質(zhì)量濃度CSCP后Caco-2細胞的存活率。將Caco-2細胞以1×104個/mL接種于96 孔培養(yǎng)板中,每孔加入細胞懸液100 μL。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液。將Caco-2細胞隨機分為空白對照組(只加MEM培養(yǎng)液)和藥物組(CSCP質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL),空白孔不接種細胞,加入等量磷酸鹽緩沖液。在培養(yǎng)箱中孵育6 h后,吸去舊培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)液100 μL,然后向每孔加10 μL CCK-8,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標儀測定450 nm波長處OD值。按式(1)計算細胞存活率。

        式中:OD1為藥物組OD值;OD2為空白對照組OD值;OD3為空白孔OD值。

        1.3.5 Caco-2細胞單層模型的建立與評價

        1.3.5.1 Caco-2細胞單層模型的建立

        取Caco-2細胞制成密度為1×105個/mL的單細胞懸液,先加入2 mL新鮮培養(yǎng)基于Transwell 6 孔板板底側(cè)(basolateral side,BL),再加入2 mL細胞懸液于6 孔板頂側(cè)(apical side,AP),接種后隔天換液,一周后每天換液??瞻卓撞唤臃N細胞,加入等量磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)至21 d,將細胞單層連同聚碳酸酯膜一同取下,透射電子顯微鏡觀察細胞分化情況。

        1.3.5.2 TEER的測定

        用Millicell-ERS電阻儀測定各孔電阻值,細胞單層的跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)按照公式(2)計算。

        式中:Rt為細胞孔電阻值/Ω;R0為空白孔電阻值/Ω;A為Transwell小室有效膜面積/cm2。

        1.3.5.3 ALP活力的測定

        ALP是Caco-2細胞刷狀緣的標志性酶,可以根據(jù)此酶的活力來分析腸上皮細胞的分化程度。使用ALP試劑盒分別測定Caco-2細胞內(nèi)、6 孔板AP側(cè)和BL側(cè)的ALP活力。Caco-2細胞單層生長至7、14、21 d時,吸干小室內(nèi)、外培養(yǎng)液,刮取細胞,用細胞裂解液破碎細胞使之釋放出ALP,按試劑盒方法測定細胞培養(yǎng)液及細胞內(nèi)ALP活力。

        1.3.6 CSCP的細胞轉(zhuǎn)運實驗

        1.3.6.1 CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉(zhuǎn)運

        取出已建立好的Caco-2細胞單層模型,吸干內(nèi)、外側(cè)培養(yǎng)液,培養(yǎng)小室內(nèi)、外側(cè)各加入2 mL 37 ℃的HBSS(Hank’s balanced salt solution),漂洗3 次,清除細胞表面干擾物質(zhì)。內(nèi)側(cè)加入2.5 mL HBSS,外側(cè)加入3.0 mL HBSS,在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min。按1.3.5.2節(jié)方法計算TEER值,選擇TEER大于400 Ω·cm2的細胞單層吸干HBSS繼續(xù)實驗。對于從AP向BL側(cè)的轉(zhuǎn)運,在AP側(cè)加入2.0 mL質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液(溶解于HBSS)作為供給池,BL側(cè)加入2.5 mL HBSS作為接收池。對于從BL向AL側(cè)的轉(zhuǎn)運,在BL側(cè)加入2.5 mL質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液(溶解于HBSS)作為供給池,AP側(cè)加入2.0 mL HBSS作為接收池。加樣后立即將Transwell板置于恒溫搖床中孵育(37 ℃、40 r/min),于0、30、60、90、120、150、180 min時分別在接收池取樣150 μL,利用HPLC測定CSCP質(zhì)量濃度。從AP向BL側(cè)轉(zhuǎn)運實驗中,不同時間點BL側(cè)吸收的藥量(累積轉(zhuǎn)運量)以QrBi表示;從BL向AP側(cè)轉(zhuǎn)運實驗中,不同時間點AP側(cè)室吸收的藥量(累積轉(zhuǎn)運量)以QrAi表示,分別按式(3)、(4)計算[17]。

        式中:0.15為取樣體積/mL;2.5和2.0分別為接收池BL側(cè)和AP側(cè)緩沖液的總體積/mL;ρri為接收池第i個時間點的實際質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        1.3.6.2 質(zhì)量濃度對CSCP轉(zhuǎn)運的影響

        細胞單層的前處理同1.3.6.1節(jié)方法,在AP側(cè)分別加入2.0 mL質(zhì)量濃度為為0.02、0.04、0.08、0.10、0.25 mg/mL的CSCP溶液,隨后的轉(zhuǎn)運實驗同1.3.6.1節(jié)方法。180 min內(nèi)累積轉(zhuǎn)運量的計算如公式(3)。

        1.3.6.3 不同藥物對CSCP轉(zhuǎn)運的影響

        為了探究CSCP在Caco-2細胞的轉(zhuǎn)運中的吸收途徑及是否受到某些轉(zhuǎn)運蛋白的介導,進行了進一步的研究。細胞單層的前處理同1.3.6.1節(jié)方法,隨后在AP側(cè)分別加入2.0 mL含有維拉帕米(100 μmol/L)、MK-571(50 μmol/L)、氧化苯砷(25 mmol/L)、去氧膽酸鈉(100 mmol/L)和不加藥物(空白對照組)的CSCP溶液(0.25 mg/mL),BL側(cè)加入2.5 mL HBSS,隨后的轉(zhuǎn)運實驗同1.3.6.1節(jié)方法。其中,維拉帕米和氧化苯砷溶解于含體積分數(shù)0.1% DMSO的HBSS中,MK-571和去氧膽酸鈉溶解于不含DMSO的HBSS中。180 min內(nèi)累積轉(zhuǎn)運量的計算如公式(3)。CSCP透過Caco-2細胞單層的表觀滲透系數(shù)Papp按式(5)計算[18]。

        式中:ΔQ為時間Δt/s內(nèi)的累積轉(zhuǎn)運量/mg;A為聚碳酸脂膜的面積(4.5 cm2);ρ0為CSCP初始質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        外排比率(efflux ratio,ER)用Papp(B-A)(從BL向AP側(cè)轉(zhuǎn)運)與Papp(A-B)(從AP向BL側(cè)轉(zhuǎn)運)的比值表示[19]。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 CSCP在不同pH值中的穩(wěn)定性分析

        圖 1 CSCP在不同pH值溶液中的穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 1 Stability of CSCP under different pH conditions

        如圖1所示,經(jīng)HPLC分析可得,CSCP在接近胃腸道環(huán)境的各pH值中基本保持穩(wěn)定,在180 min內(nèi)降解緩慢,180 min時仍有90%以上保持原型。

        2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性分析

        圖 2 CSCP在人工胃液(A)和人工腸液(B)中的穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 2 Stability of CSCP in artif i cial gastric juice (A) and artif i cial intestinal juice (B)

        如圖2所示,在前10 min內(nèi),CSCP在人工胃液(圖2A)和人工腸液(圖2B)內(nèi)均降解了6%左右;10 min后CSCP在兩種溶液中均降解緩慢;180 min后,在人工胃液和人工腸液中最終分別剩余94.02%和94.46%。人工胃液和人工腸液對CSCP穩(wěn)定性的影響并不大,可能是胃蛋白酶的水解位點為色氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸的氨基端,而Edman自動降解法測得CSCP的氨基端為甘氨酸;而且CSCP是由鱈魚皮膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到,所以腸液中的胰蛋白酶對CSCP幾乎沒有影響,該結(jié)果與接近腸道pH值時的穩(wěn)定性基本一致。

        2.3 不同質(zhì)量濃度CSCP對Caco-2細胞存活率的影響

        表 1 不同質(zhì)量濃度CSCP對Caco-2細胞存活率的影響Table 1 Effect of CSCP at various concentrations on Caco-2 cell viability

        CCK-8實驗數(shù)據(jù)(表1)表明,隨著CSCP質(zhì)量濃度的增加,Caco-2細胞存活率逐漸降低。在CSCP質(zhì)量濃度為0.10、0.25 mg/mL時,Caco-2細胞的存活率大于90%,在質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時,細胞存活率降低,達到77.31%,與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。而且,轉(zhuǎn)運實驗在3 h內(nèi)完成,遠少于CCK-8實驗的6 h。因此,選取細胞存活率大于90%時CSCP的質(zhì)量濃度進行后續(xù)的轉(zhuǎn)運實驗,0.25 mg/mL為最高轉(zhuǎn)運質(zhì)量濃度。

        2.4 Caco-2細胞單層模型的驗證結(jié)果

        在6 孔板上培養(yǎng)21 d后,倒置顯微鏡下觀察到Caco-2細胞連接緊密,邊界清晰,形成了一層致密的細胞單層(圖3)。透射電子顯微鏡觀察聚碳酸酯膜上的Caco-2細胞單層(圖4),發(fā)現(xiàn)其微絨毛形成的刷狀緣整齊致密,細胞間形成緊密連接和橋粒,說明Caco-2細胞已出現(xiàn)極化,呈不對稱分布,具有小腸上皮細胞的某些結(jié)構(gòu)特征。

        圖 3 倒置顯微鏡下Caco-2細胞單層上皮表面觀察結(jié)果(×200)Fig. 3 Epithelium monolayer surface under an inverted microscope (× 200)

        圖 4 透射電子顯微鏡下Caco-2細胞側(cè)面連接觀察結(jié)果(×40 000)Fig. 4 Caco-2 cell connection under an transmission electron microscope (× 40 000)

        2.5 Caco-2細胞單層模型的評價結(jié)果

        2.5.1 Caco-2細胞單層TEER值分析

        本實驗中C a c o-2細胞單層T E E R值在(580.2±36.1)Ω·cm2之間變動。細胞TEER值超過400 Ω·cm2才能用于轉(zhuǎn)運實驗,得到可靠的結(jié)果[20],表明本實驗條件下,Caco-2細胞成膜情況較好,致密性優(yōu)良,可以用于CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運實驗。

        2.5.2 Caco-2生長過程中ALP活力的變化

        表 2 Caco-2細胞單層ALP活力變化Table 2 Change in ALP activity of Caco-2 cell monolayer

        由表2可見,細胞內(nèi)ALP活力隨著時間的延長迅速增加,14 d以后增長趨勢稍緩,到第21天ALP活力比第7天增加了4 倍左右,說明Caco-2細胞逐漸分化成熟,AP側(cè)與BL側(cè)ALP活力比值的升高證明ALP的分布極不對稱,細胞出現(xiàn)了非常明顯的極化現(xiàn)象。

        2.6 CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉(zhuǎn)運分析

        圖 5 時間對CSCP跨Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運的影響Fig. 5 Time-course curves of CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

        如圖5所示,初始質(zhì)量濃度一定時,轉(zhuǎn)運量隨時間的延長而增加,尤其是AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運在1 h后呈近似線性增加,且3 h內(nèi)未見飽和;而BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量在前2 h基本為0,2 h后緩慢增加。結(jié)果表明CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉(zhuǎn)運均存在明顯的時間依賴性,且在60~150 min時,AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運速率遠大于反向轉(zhuǎn)運速率,AP側(cè)到BL側(cè)3 h內(nèi)轉(zhuǎn)運量也明顯高于BL側(cè)到AP側(cè),提示CSCP的轉(zhuǎn)運具有方向性,且受到某種轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用,從累積轉(zhuǎn)運量來看,Caco-2細胞單層對CSCP的吸收作用大于外排作用。

        2.7 質(zhì)量濃度對CSCP跨膜轉(zhuǎn)運的影響分析

        圖 6 質(zhì)量濃度對CSCP跨Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運的影響Fig. 6 Concentration-dependent CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

        由圖6可以發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)運的3 h內(nèi),CSCP的累積轉(zhuǎn)運量隨質(zhì)量濃度的升高而增加,說明CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運是濃度依賴型,且在實驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)沒有達到飽和,提示CSCP在Caco-2細胞單層的轉(zhuǎn)運以被動轉(zhuǎn)運為主。

        2.8 藥物種類對CSCP跨膜轉(zhuǎn)運的影響

        圖 7 藥物種類對CSCP轉(zhuǎn)運的影響Fig. 7 Effects of drugs on CSCP transport

        多肽和蛋白質(zhì)藥物的口服吸收途徑主要包括載體轉(zhuǎn)運、胞飲作用和細胞旁路途徑[21]。如圖7所示,與空白對照組相比,去氧膽酸鈉明顯增強了CSCP的跨膜轉(zhuǎn)運(P<0.01),去氧膽酸鈉是旁路轉(zhuǎn)運促進劑,能打開細胞間的緊密連接[22],表明CSCP的主要跨膜機制是細胞旁路途徑;MK-571為多藥耐藥蛋白抑制劑[23],也增加了CSCP的轉(zhuǎn)運,且與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05);維拉帕米(P-糖蛋白抑制)和氧化苯砷(內(nèi)吞抑制劑)對CSCP的轉(zhuǎn)運沒有顯著影響,表明在CSCP的吸收過程中,內(nèi)吞不是主要機制,多藥耐藥蛋白介導了CSCP的外排。不同轉(zhuǎn)運條件下的Papp見表3。

        由表3可知,比較Papp發(fā)現(xiàn),Papp(B-A)/Papp(A-B)值小于1,即ER值小于1,提示CSCP的轉(zhuǎn)運具有方向性,攝取作用大于外排作用。加入去氧膽酸鈉后,Papp增加為空白對照的4 倍左右,差異極顯著(P<0.01);加入MK-571后Papp也有所增加,約為空白對照組的1.4 倍,與空白對照組相比差異顯著(P<0.05),其余藥物對Papp沒有顯著影響。

        3 討 論

        多年來人們一直認為蛋白質(zhì)口服后,大多數(shù)在體內(nèi)酶的作用下被完全水解為氨基酸再吸收入血[24]。近年來,一些以蛋白質(zhì)為主的藥物口服后可經(jīng)胃腸道吸收進入血液循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),口服重組水蛭素-2可部分以其原型活性形式被吸收入血并產(chǎn)生抗凝作用,回腸是其最佳吸收部位[25-26]。張倩等[27]發(fā)現(xiàn)鹿茸中分子質(zhì)量小于45 kDa的蛋白可以透過腸壁吸收,口服給予大鼠異硫氰酸熒光素標記的鹿茸蛋白,在血清中能檢測到熒光蛋白。關(guān)于胰島素的研究表明,胰島素在腸道引入后,被上皮細胞吸收并進入血液循環(huán)起到降低血糖作用,通過組織切片的免疫化學顯示,胰島素以內(nèi)吞的形式被吸收[28]。大量研究表明一些具有生理活性的多肽和蛋白質(zhì)可以被腸道上皮細胞吸收而進入血液循環(huán),但生物利用度并不高。為了提高其生物利用度、開發(fā)蛋白質(zhì)和多肽類藥物的口服制劑,一些新的劑型和給藥方法成為研究熱點,目前主要有結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)、脂質(zhì)體載體和微乳載藥等[21]。

        口服是最方便也是最容易讓人接受的給藥途徑,但有些藥物因在胃腸道不穩(wěn)定、生物利用度低等原因而不能制成口服劑型。因此,在設(shè)計、優(yōu)化、選擇口服藥物時,預(yù)測其腸道吸收是主要考慮因素之一。用于評估藥物吸收的一系列臨床前方法包括計算機、體內(nèi)、體外、在體和離體等方法[29]。然而,當今社會和科學對動物的關(guān)愛以及制藥行業(yè)對快速、經(jīng)濟和可靠模型的需求,使得人們極其迫切地尋求和建立與體內(nèi)吸收具有良好相關(guān)性的模型。Caco-2細胞模型法最早由Hidalgo等[30]在1989年提出,一旦匯合成完整細胞單層,Caco-2細胞就會分化成在結(jié)構(gòu)和功能上與成熟小腸細胞類似的細胞。在標準培養(yǎng)條件下,典型的微絨毛、一些分子的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、代謝酶和細胞間的緊密連接都能表達[31]。而且Caco-2細胞來源于人,同源性較好,實驗條件易受控制。基于以上特征,Caco-2細胞模型能從細胞水平評估藥物的黏膜滲透率,從而闡明藥物的腸吸收機制。

        目前,膠原蛋白肽的保健功能主要在抗氧化、美容護膚、止血和免疫等方面[32],還鮮有關(guān)于膠原蛋白肽對肝損傷保護作用的研究?,F(xiàn)有的肝病治療主要依靠化學藥物,但化學藥物都具有一定的毒性。CSCP是本課題組從水產(chǎn)加工副產(chǎn)物鱈魚皮中提取獲得的膠原蛋白肽,其具有良好的護肝活性[12-13],無毒且安全,是理想的輔助治療保健品。為有效地開發(fā)利用CSCP,本研究建立了Caco-2細胞單層模型并研究CSCP跨腸細胞的轉(zhuǎn)運特性,評估CSCP的黏膜滲透率,探究CSCP的跨膜吸收機制。在進行轉(zhuǎn)運實驗前,首先對CSCP的細胞毒性進行評價,選擇細胞存活率大于90%的質(zhì)量濃度進行實驗。若轉(zhuǎn)運質(zhì)量濃度對Caco-2細胞有毒性,則轉(zhuǎn)運過程中TEER值可能下降到低于標準值,細胞間緊密連接變松散,計算得到的轉(zhuǎn)運量和Papp會比實際值偏大。實驗表明CSCP跨Caco-2細胞轉(zhuǎn)運受到多種因素的影響,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性,Papp也隨時間的延長逐漸增大。化合物的Papp與人體內(nèi)的吸收率具有良好的相關(guān)性,Papp為1×10-6~10×10-6cm/s,表明體內(nèi)吸收適中,相當于給藥劑量的20%~70%[33]。本實驗測得CSCP的Papp為(8.51±0.27)×10-6cm/s,說明CSCP吸收良好。由于Caco-2細胞單層的緊密連接比人和動物小腸的更緊密一些[31],通過細胞旁路轉(zhuǎn)運的化合物在Caco-2細胞模型中的滲透率比體內(nèi)吸收稍低。

        4 結(jié) 論

        CSCP在模擬胃腸道環(huán)境中較為穩(wěn)定,其跨Caco-2細胞單層轉(zhuǎn)運的機制為細胞旁路途徑,其外排受到多藥耐藥蛋白的介導;CSCP的Papp為(8.51±0.27)×10-6cm/s,說明其在體內(nèi)吸收適中。本研究從細胞水平探究了CSCP在腸道中的吸收機制,為深入研究CSCP的口服吸收機制及藥物代謝動力學提供依據(jù)。

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