付丹丹，王巧華,2,*，馬美湖，許 鋒

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070；

3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞蛋是人們?nèi)粘Ｉ钪袛z取蛋白質(zhì)的重要來源之一，雞蛋在貯藏過程中的品質(zhì)變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括蛋質(zhì)量損失率的增加[1]、pH值的變化[2]等。卵白蛋白占蛋清總蛋白的54%～63%，是蛋清蛋白的主要組成成分[3]，貯存期間蛋清中S-卵白蛋白相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由新產(chǎn)蛋的5%上升至冷藏6 個(gè)月后的81%[4]；因此蛋清蛋白的變化與雞蛋品質(zhì)的關(guān)系是揭示雞蛋品質(zhì)變化規(guī)律的最本質(zhì)因素。通過對(duì)蛋清S-卵白蛋白含量變化的研究可以了解雞蛋品質(zhì)變化的規(guī)律，其品質(zhì)變化也可以通過S-卵白蛋白含量的改變得到很好的反映；同時(shí)，雞蛋中S-卵白蛋白的形成不依賴于雞齡、營養(yǎng)狀況和蛋質(zhì)量等因素，且顯示出高的重復(fù)性與低的自然變異性，是評(píng)價(jià)雞蛋品質(zhì)的潛在方法[5]。因此有關(guān)雞蛋貯藏期蛋白變化與品質(zhì)關(guān)系的研究是蛋品加工基礎(chǔ)研究和保鮮研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。目前關(guān)于S-卵白蛋白含量的研究主要集中在其形成機(jī)理、凝膠特性等理化性質(zhì)方面[6-9]，也有少量對(duì)雞蛋pH值、溫度、貯藏條件對(duì)S-卵白蛋白形成影響的研究[10-11]，但在雞蛋品質(zhì)對(duì)S-卵白蛋白含量形成影響方面的研究還不多見[12]；此外，有學(xué)者的研究表明高光譜、近紅外光譜等無損檢測的光譜信息與蛋清的哈夫值、酸堿度、黏度、蛋白質(zhì)含量等有一定的相關(guān)性[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)將貯藏期間的雞蛋品質(zhì)變化與S-卵白蛋白含量變化視為一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)，系統(tǒng)性地分析了雞蛋品質(zhì)與S-卵白蛋白含量的相關(guān)關(guān)系，并研究了各雞蛋品質(zhì)參數(shù)對(duì)S-卵白蛋白含量變化的影響程度，以期在不打破雞蛋的情況下就可以從生化本質(zhì)的角度揭示蛋品品質(zhì)變化機(jī)制，建立無損快速的雞蛋品質(zhì)檢測方法，實(shí)現(xiàn)蛋品品質(zhì)的有效無損監(jiān)控。并以S-卵白蛋白含量為自變量建立了等價(jià)蛋齡模型，為雞蛋產(chǎn)業(yè)的貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)日產(chǎn)的新鮮海蘭褐殼雞蛋共108 枚，購于湖北武漢九峰養(yǎng)雞場。

NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4、NaCl、CH3COONa、CH3COOH、CuSO4·5H2O、C4O6H2KNa·4H2O等試劑均購于武漢百惠生物有限公司。

磷酸鹽緩沖液：將6.85 g NaH2PO4·2H2O與21.55 g Na2HPO4溶解于500 mL去離子水中，備用。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)取50 mL稀釋20 倍，調(diào)節(jié)pH值至7.5。

沉淀劑：0.5 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L CH3COONa溶液以體積比1∶1混合，用CH3COOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.7。

雙縮脲溶液：將3.6 g CuSO4·5H2O與7.2 g C4O6H2KNa·4H2O溶解于1 L的去離子水中，將72 g NaOH溶解于720 mL的去離子水中，在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)以兩者體積比為1∶1混合備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SF2000電子數(shù)顯卡尺 桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司；JA2002電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司；MP511 pH計(jì) 上海三信儀表廠；HH-8集熱式數(shù)顯水浴鍋國華電氣有限公；D U 7 0 0紫外-可見分光光度計(jì)美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將所有雞蛋放置于（22±1）℃、相對(duì)濕度65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏。每隔5 d隨機(jī)取樣，即貯藏第1、6、11、16、21、26、31、36、41天時(shí)，每次隨機(jī)挑選出12 枚雞蛋，依次編號(hào)，分別測定每枚雞蛋的品質(zhì)參數(shù)及卵白蛋白的含量。

1.3.2 雞蛋品質(zhì)參數(shù)的測定

1.3.2.1 哈夫值的測定

用電子天平分別稱取每枚雞蛋的質(zhì)量（m/g），然后將其打破，手動(dòng)測定雞蛋哈夫值，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測定每枚雞蛋濃蛋白的高度，每枚雞蛋測3 次，并取其平均值作為每枚雞蛋濃蛋白高度值（H/mm）。按照公式（1）計(jì)算雞蛋的哈夫值[16]。

1.3.2.2 蛋黃指數(shù)的測定

利用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測定每枚雞蛋的蛋黃高度和蛋黃直徑，每個(gè)雞蛋測3 次，取其平均值作為雞蛋最終的蛋黃高度（h/mm）和蛋黃直徑（d/mm）。按照公式（2）計(jì)算雞蛋的蛋黃指數(shù)[17]。

1.3.2.3 蛋清pH值的測定

利用分蛋器將蛋清蛋黃分離，校準(zhǔn)pH計(jì)，測定每個(gè)雞蛋蛋清的pH值，每個(gè)雞蛋測3次，取其平均值作為雞蛋最終的pH值。

1.3.2.4 卵白蛋白含量的測定

將用蛋清分離器分離出來的每枚雞蛋的蛋清分別置于1～12號(hào)100 mL小燒杯中，并分別在4 ℃條件下用磁力攪拌器攪拌均勻；用分析天平分別量?。?.00±0.05）g的蛋清至13～24號(hào)100 mL小燒杯中；并用70 mL量筒分別量取25 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液加入到每個(gè)小燒杯中，磁力攪拌5 min；用1 mL移液槍分別移取5 mL的混合溶液于2 支20 mL的玻璃密閉試管中（分別標(biāo)記為iA、iB，i為雞蛋編號(hào)）；將iA號(hào)試管同時(shí)放置于75 ℃的水浴鍋中水浴加熱30 min后冷卻；向iA、iB試管中分別加入5 mL沉淀劑，混合傾倒于離心管中，并再分別向每個(gè)試管中加入5 mL沉淀劑沖洗試管內(nèi)壁，盡量將試管中的液體轉(zhuǎn)入相應(yīng)的離心管中?；靹螂x心管中的溶液，靜置10 min后，12 000 r/min離心5 min，分別從每個(gè)離心管上部用移液槍移取2 mL上清液至10 mL離心管中，向每個(gè)10 mL離心管中分別加入4 mL雙縮脲溶液，室溫下靜置30 min；用紫外-可見分光光度計(jì)測定每個(gè)樣品在540 nm波長處的吸光度（A），對(duì)照樣為2 mL去離子水與4 mL雙縮脲溶液混合液。按照式（3）計(jì)算S-卵白蛋白含量[18]。

1.3.2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)分析是對(duì)一個(gè)系統(tǒng)發(fā)展變化態(tài)勢的定量分析的方法，是一種多因素統(tǒng)計(jì)分析法，它通過確定參考數(shù)列和多個(gè)比較數(shù)列的幾何形狀相似程度來判斷其聯(lián)系的緊密性，能夠反映曲線間的關(guān)聯(lián)程度，這與Pearson相關(guān)性分析有所不同，Pearson相關(guān)性分析僅是對(duì)變量之間的線性相關(guān)程度進(jìn)行分析[19-21]，且相關(guān)性不等于因果性?；疑P(guān)聯(lián)分析的基本步驟如下：1）建立反應(yīng)系統(tǒng)行為特征的參考數(shù)列x0（式（4））；2）建立影響系統(tǒng)行為的比較數(shù)列xi（式（5））；3）求初值化變換矩陣xi′（式（6））；4）求差序列Δi（k）（式（7））；5）計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)ξi（k）（式（8））；6）計(jì)算關(guān)聯(lián)度ζi（式（9））并排序。

式（8）中：Φ為分辨系數(shù)，其作用在于提高關(guān)聯(lián)系數(shù)間的差異顯著性，Φ∈（0，1），一般取Φ＝0.5。關(guān)聯(lián)系數(shù)是參考數(shù)列和比較數(shù)列在各時(shí)期的關(guān)聯(lián)程度值。

關(guān)聯(lián)度是參考數(shù)列和比較數(shù)列在整個(gè)時(shí)段中的平均關(guān)聯(lián)程度值。關(guān)聯(lián)度越大，說明該比較數(shù)列對(duì)參考數(shù)列的影響越大，反之，則影響越小[22]。在計(jì)算完關(guān)聯(lián)度后對(duì)所有獲得的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序，通過比較關(guān)聯(lián)度，就可以獲得多個(gè)因素對(duì)參考數(shù)列的影響程度，從而找出影響參考變量的主次因素[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過MATLAB 2014a軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。利用SPSS 12.0軟件中的Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)關(guān)系研究，并利用One-way ANOVA中的LSD比較法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

業(yè)內(nèi)沒有根據(jù)S-卵白蛋白含量對(duì)雞蛋分類的標(biāo)準(zhǔn)，國際上建立了通用的雞蛋哈夫值的分類標(biāo)準(zhǔn)，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，以S-卵白蛋白含量為因變量（x）、哈夫值為自變量（y）建立兩者之間的指數(shù)回歸關(guān)系（式（10））。

y=4.367 8×e-0.0294x（R=0.912 9） （10）

依據(jù)雞蛋哈夫值分類的標(biāo)準(zhǔn)[24]，將x＝72、60分別帶入上式中，得y＝53%、75%，因此將S-卵白蛋白含量分為3 類：y＜53%、53%＜y＜75%、y＞75%。各雞蛋品質(zhì)參數(shù)與S-卵白蛋白含量之間的相關(guān)關(guān)系見表1。

表 1 S-卵白蛋白含量與各雞蛋品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coef ficients between S-ovalbumin content and egg quality parameters

2.1 雞蛋新鮮度品質(zhì)指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的相關(guān)性

2.1.1 哈夫值與S-卵白蛋白含量的相關(guān)性

雞蛋新鮮度對(duì)貯藏期間蛋清S-卵白蛋白含量的影響見圖1。不同S-卵白蛋白含量的雞蛋之間的新鮮度差異極顯著（P＜0.01），并且隨著S-卵白蛋白含量的增加，雞蛋哈夫值逐漸減小。雞蛋哈夫值大小與蛋清S-卵白蛋白含量存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.913，P＜0.01）。由哈夫值的定義，其值由蛋質(zhì)量和濃蛋白高度決定，由表1可以看出，蛋質(zhì)量與S-卵白蛋白含量盡管也存在負(fù)相關(guān)性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其線性相關(guān)程度比濃蛋白高度與S-卵白蛋白含量的線性相關(guān)程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多，這與Masaaki[5]報(bào)道的S-卵白蛋白的形成不依賴于蛋質(zhì)量相一致。因此雞蛋哈夫值對(duì)S-卵白蛋白含量的影響主要源于濃蛋白高度對(duì)S-卵白蛋白含量的影響，其原因可能是卵白蛋白中的巰基對(duì)濃蛋白高度的變化起到作用[7]。

圖 1 不同S-卵白蛋白含量下的哈夫值Fig. 1 Haugh unit at different S-ovalbumin contents

2.1.2 蛋黃指數(shù)與S-卵白蛋白含量的相關(guān)性

圖 2 不同S-卵白蛋白含量下的蛋黃指數(shù)Fig. 2 Egg yolk index at different S-ovalbumin contents

由表1可知，蛋黃指數(shù)與S-卵白蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.900，P＜0.01），即蛋黃指數(shù)與S-卵白蛋白含量的線性相關(guān)程度高，S-卵白蛋白含量越高，蛋黃指數(shù)越小。由圖2可知，不同S-卵白蛋白含量雞蛋的蛋黃指數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01），且隨著S-卵白蛋白含量的增加，蛋黃指數(shù)呈下降趨勢。此外，蛋黃指數(shù)與哈夫值存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（R＝0.901，P＜0.01），與pH值存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.636，P＜0.01）。

2.1.3 蛋清pH值與S-卵白蛋白含量的相關(guān)性

溫度和pH值是蛋清N-卵白蛋白轉(zhuǎn)化為S-卵白蛋白的主要因素[25]，由表1可知，蛋清pH值與S-卵白蛋白含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.648，P＜0.01），其相關(guān)程度沒有哈夫值與蛋黃指數(shù)的相關(guān)性高。由圖3可知，不同S-卵白蛋白含量下的蛋清pH值差異極顯著（P＜0.01），且隨著S-卵白蛋白含量的增加，pH值先增大后減小。此外，pH值與哈夫值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.700，P＜0.01）；pH值與蛋質(zhì)量無顯著相關(guān)關(guān)系（R＝0.053，P＞0.05）；pH值與蛋黃指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.636，P＜0.01），與蛋黃直徑呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.612，P＜0.01），與蛋黃高度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.553，P＜0.01）。

圖 3 不同S-卵白蛋白含量下的pH值Fig. 3 pH at different S-ovalbumin contents

2.2 雞蛋新鮮度指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的灰色關(guān)聯(lián)度分析

運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，將貯藏期間雞蛋品質(zhì)變化與S-卵白蛋白含量的變化視為一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)，通過計(jì)算和分析雞蛋哈夫值、蛋黃指數(shù)、pH值等多因素與S-卵白蛋白含量之間的灰色關(guān)聯(lián)度及其大小次序，確定出影響S-卵白蛋白含量的主要因素，繼而得出雞蛋品質(zhì)多因素與S-卵白蛋白含量之間關(guān)系的定量化分析結(jié)果。由于各雞蛋品質(zhì)因素的量綱不同，不同量綱的因素之間難以比較；因此在進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析之前，采用均一化的方法對(duì)各品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行無量綱處理[26]，其計(jì)算公式如式（11）所示。

式中：Mij’為第i行第j列的一個(gè)數(shù)值的無量綱值；Mij為第i行第j列的一個(gè)數(shù)值；Mj為第j列的平均值。

圖 4 貯藏期間無量綱化后的雞蛋新鮮度指標(biāo)及S-卵白蛋白含量的變化規(guī)律Fig. 4 Variation in non-dimensionalized egg freshness indexes and S-ovalbumin content

由圖4可知，S-卵白蛋白含量隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸增加，哈夫值和蛋黃指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸減小，pH值隨著貯藏時(shí)間的延長先增加后減小。

選取S-卵白蛋白含量作為參考序列，各雞蛋品質(zhì)指標(biāo)作為比較數(shù)列。依據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度的計(jì)算步驟，計(jì)算雞蛋品質(zhì)因素與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關(guān)聯(lián)度見表2。不同貯藏時(shí)間的雞蛋新鮮度指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的相對(duì)灰色關(guān)聯(lián)度變化趨勢如圖5所示。

表 2 雞新鮮度指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關(guān)聯(lián)度Table 2 Comprehensive gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content

圖 5 貯藏期間雞蛋新鮮度指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的灰色關(guān)聯(lián)度變化趨勢Fig. 5 Variation in gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content during storage

由表2可知，貯期各新鮮度指標(biāo)值對(duì)S-卵白蛋白含量的綜合灰色關(guān)聯(lián)度排序?yàn)椋簆H值＞蛋黃指數(shù)＞哈夫值。一般情況下，灰色關(guān)聯(lián)度在0.8以上，則認(rèn)為參考數(shù)列與比較數(shù)列曲線間的關(guān)聯(lián)程度高，灰色關(guān)聯(lián)度在0.3～0.8之間，則可認(rèn)為曲線間有弱的關(guān)聯(lián)性，灰色關(guān)聯(lián)度小于0.3，則認(rèn)為曲線間沒有關(guān)聯(lián)性。

由圖5可知，貯藏期間雞蛋新鮮度指標(biāo)與S-卵白蛋白含量的灰色關(guān)聯(lián)度在不斷變化，在貯藏第21天時(shí)，哈夫值和蛋黃指數(shù)與S-卵白蛋白含量的關(guān)聯(lián)度達(dá)到最高，約為0.9；pH值在貯藏第26天時(shí)與S-卵白蛋白含量的灰色關(guān)聯(lián)度達(dá)到最高，大于0.9。關(guān)聯(lián)程度越高，曲線同步變化程度越高。

綜上，每個(gè)品質(zhì)因素與S-卵白蛋白含量的綜合灰色關(guān)聯(lián)度均大于0.6（表2），說明每個(gè)品質(zhì)因素都對(duì)S-卵白蛋白含量有影響，其中pH值的影響最大，與S-卵白蛋白含量的同步變化程度最高，在各雞蛋品質(zhì)影響因素中，是影響S-卵白蛋白含量變化的主導(dǎo)因素，本研究結(jié)論與Omana等[27]研究得出的S-卵白蛋白的增加可能是由于蛋清pH值增加的結(jié)論相吻合。

2.3 等價(jià)蛋齡預(yù)測模型

雞蛋不僅含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白，而且價(jià)格低廉，是消費(fèi)者日常生活中的必備品，其新鮮度對(duì)消費(fèi)者的食品安全有著重要的影響，有關(guān)貯藏期間雞蛋品質(zhì)的評(píng)價(jià)和預(yù)測及其與貯藏時(shí)間的關(guān)系也一直是食品加工和保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而蛋齡（即雞蛋貯藏的時(shí)間）并不能準(zhǔn)確反映不同貯藏條件下雞蛋的真實(shí)鮮度[29-30]；因此，有學(xué)者提出利用等價(jià)蛋齡來估算不同貯藏條件下的雞蛋新鮮度[28]。對(duì)在22 ℃條件下貯藏的雞蛋蛋清中的S-卵白蛋白含量與貯藏時(shí)間之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明S-卵白蛋白含量與貯藏時(shí)間呈極顯著相關(guān)（R＝0.992，P＜0.01）。本研究選取22 ℃、相對(duì)濕度65%的貯藏條件下獲取的S-卵白蛋白含量建立等價(jià)蛋齡的預(yù)測模型，用于評(píng)價(jià)貨架期不同貯藏條件下商業(yè)雞蛋的新鮮度。

圖 6 雞蛋等價(jià)蛋齡預(yù)測模型Fig. 6 Prediction model of equivalent egg age

以S-卵白蛋白含量為自變量，通過二次多項(xiàng)式回歸模型建立雞蛋等價(jià)蛋齡預(yù)測模型，如圖6所示，預(yù)測方程為：y＝0.001 03 x2+0.409x－8.260 3；其中y為雞蛋等價(jià)蛋齡，x為S-卵白蛋白含量。預(yù)測值與實(shí)測值的決定系數(shù)R2＝0.986 81，P＜0.01。由此可見，建立的等價(jià)蛋齡模型可靠性高，預(yù)測性比黃群等[10]等建立的指數(shù)回歸預(yù)測模型準(zhǔn)確性更高。

3 結(jié) 論

雞蛋哈夫值與S-卵白蛋白含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.913，P＜0.01），蛋黃指數(shù)與S-卵白蛋白含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝-0.900，P＜0.01），pH值與S-卵白蛋白含量間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.648，P＜0.01）。

蛋質(zhì)量與S-卵白蛋白含量盡管也存在極顯著負(fù)相關(guān)性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其線性相關(guān)程度比濃蛋白高度與S-卵白蛋白含量的線性相關(guān)程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多。

各品質(zhì)因素與S-卵白蛋白含量的灰色關(guān)聯(lián)度均大于0.6，哈夫值、蛋黃指數(shù)及pH值對(duì)S-卵白蛋白含量的綜合關(guān)聯(lián)度排序?yàn)椋簆H值（灰色關(guān)聯(lián)度為0.742）＞蛋黃指數(shù)（灰色關(guān)聯(lián)度為0.663）＞哈夫值（灰色關(guān)聯(lián)度為0.646），pH值是影響S-卵白蛋白含量變化的主導(dǎo)因素。

在22 ℃貯藏條件下，S-卵白蛋白含量與貯藏時(shí)間呈極顯著正相關(guān)（R＝0.992，P＜0.01）。以S-卵白蛋白含量為自變量，通過二次多項(xiàng)式回歸模型建立雞蛋等價(jià)蛋齡預(yù)測模型，其決定系數(shù)R2＝0.986 81，P＜0.01，可靠性高。