鐘 霞，王 麗，王洪連，沈宏春，徐川嵐，劉育杭

(1.四川省瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心,四川 瀘州 646000；2.四川省瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

肝纖維化(Liver Fibrosis)的發(fā)生與慢性肝損傷的病因有關(guān)，包括乙型肝炎和丙型肝炎、飲酒、脂肪肝、膽汁淤積和自身免疫性肝炎，表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的失衡，若纖維化持續(xù)進展，會出現(xiàn)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂和功能受損，誘發(fā)肝硬化、肝衰竭，甚至導(dǎo)致肝癌發(fā)生[1]。目前防治肝纖維化已成為研究熱點，而構(gòu)建一種有效的肝纖維化動物模型是進行肝纖維化研究的重要基礎(chǔ)。采用四氯化碳(CCl4)化學(xué)誘導(dǎo)方式建立肝纖維化模型，是常用的一種簡單、快速、高效的造模方式，而不同品系的小鼠對于該造模方法的敏感性不同，模型構(gòu)建的結(jié)果也會有所差別。本實驗分別對兩種品系小鼠采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化造模方式進行造模，對比觀察兩者肝臟結(jié)構(gòu)和功能等方面的差異，以探求一種高效、穩(wěn)定的肝纖維化疾病模型。

1 資料與方法

1.1實驗動物：選擇30只ICR(Institute of Cancer Research)小鼠和30只C57BL/6小鼠，SPF級，均為雄性，8周齡，體重20～25 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心[許可證：SYXK(川)2013-065]。

1.2藥物與試劑：CCl4溶液購于成都金山化學(xué)試劑有限公司；橄欖油購于上海生工生物工程股份有限公司(批號：C316BA0013)；正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；苦味酸-天狼星紅染色試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司(批號：PT036)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購于碧云天試劑有限公司(批號：C0105)；Fibronectin抗鼠單克隆抗體購自abcam公司(貨號：ab11575)；collgen-I、collgen-III抗體購自Cell Signaling Technology 公司；ɑ- SMA抗兔單克隆抗體購自abcam公司。

1.3方法

1.3.1模型建立及標(biāo)本采集：ICR小鼠和C57小鼠各30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將ICR小鼠隨機分為ICR正常組、ICR陰性對照組(橄欖油)、ICR模型組；將C57小鼠分為C57正常組、C57陰性對照組和C57模型組，每組各10只，自由飲水和進食。用橄欖油將四氯化碳分析純配制成20% 的CCl4混懸液。兩模型組予以腹腔注射2 ml/100 g 20% CCl4混懸液，1次/d，每注射5 d，間隔2 d，連續(xù)8周；兩組對照組予以注射相同劑量橄欖油，正常組不做任何處理。觀察小鼠活動狀態(tài)、飲水量、精神狀況及體重變化等一般情況。8周后，戊巴比妥鈉麻醉，收集全血分離血清；收集肝臟組織，部分暫時凍存于-80℃，部分予以4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋。

1.3.2檢測肝臟功能：各組小鼠連續(xù)給藥8周后，腹腔注射麻醉，收集全血分離血清，全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT水平，評估肝臟功能損害。

1.3.3觀察肝臟組織病理形態(tài)：采集肝臟組織，用10%中性甲醛固定，脫水包埋后石蠟切片。對肝組織切片進行HE和苦味酸-天狼星紅染色，光鏡觀察病理形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4Western blot檢測肝纖維化相關(guān)指標(biāo)蛋白水平：稱取小鼠肝組織 0.05 g，提取肝組織蛋白。取50 μg蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移后，用5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Fibronectin、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ一抗(稀釋比例 1∶1 000)4 ℃ 孵育過夜，TBST洗滌3×5 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗(稀釋比例1∶3 000)常溫孵育1 h，TBST 洗滌3×5 min后，采用凝膠成像儀進行檢測，結(jié)果以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的相對灰度值表示。

1.3.5Real time PCR檢測肝纖維化相關(guān)指標(biāo)mRNA水平：采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法測定組織α-SMA mRNA水平的表達。用trizol法提取組織總 RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測所得總RNA的純度和濃度，再用cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，40 個擴增循環(huán)(95 ℃ 15 s，55℃ 15 s，72 ℃ 30 s)。Real-time PCR反應(yīng)體系如下：SYBR green PCR mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，稀釋cDNA 9 μl，共計20 μl。每個樣本重復(fù)測量3次，用2-△△Ct法分析目的基因相對表達量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成，見表1。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血清AST、ALT含量測定結(jié)果：與對照組比較，2個模型組的小鼠血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.05)，而ICR小鼠模型組和C57小鼠模型組相比，ICR小鼠的AST、ALT含量明顯增高(P<0.05)。見表2。

2.2病理組織學(xué)結(jié)果

2.2.1肝臟HE染色結(jié)果：兩正常組及兩對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，小葉間和匯管區(qū)基本無膠原纖維分布。C57小鼠模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞顆粒變性明顯，可見肝細(xì)胞脂肪變性。ICR小鼠模型組可見肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪空泡堆積，脂肪變性較C57模型組更為明顯，另外可見中央靜脈周圍纖維增多并向外延伸，形成纖維間隔。見圖1。

表1引物基因序列

組別AST ICR小鼠 C57小鼠 ALT ICR小鼠 C57小鼠 正常組125.800 0±8.786130.800±12.91139.000±7.51658.000±9.848對照組145.200 0±18.660166.600±33.21549.000±17.02991.600±30.753模型組4 222.800±1 034.243①3 052.200±585.951①3 473.400±1 669.293①2 376.600±500.397①

注：與對照組比較，①P<0.05

圖1 兩種品系小鼠蘇木精伊紅(HE)染色比較(200×)：A：ICR小鼠正常組；B：ICR小鼠對照組；C：ICR小鼠模型組；D：C57小鼠正常組；E：C57小鼠對照組；F：C57小鼠模型組

2.2.2肝臟苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果：兩正常組及兩對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，僅有少量血管壁著紅色。C57小鼠模型組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量著紅色的纖維組織增生，形成纖維間隔及假小葉，肝細(xì)胞排列緊密性下降，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性。與C57小鼠模型組相比，ICR小鼠模型組可見大量粗大的膠原纖維沉積，纖維間隔更多更寬，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，另外可見部分肝細(xì)胞壞死。

2.3Western bolt檢測纖維化通路相關(guān)蛋白 ：蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠肝組織中Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的蛋白含量，與對照組比較，兩組CCl4模型組均明顯增高(P<0.001)；而兩組小鼠模型組相比較，ICR模型組的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肝組織Western blot結(jié)果：A：ICR小鼠正常組；B：ICR小鼠對照組；C：ICR小鼠模型組；D：C57小鼠正常組；E：C57小鼠對照組；F：C57小鼠模型組

圖4 各組小鼠肝組織纖維化相關(guān)蛋白檢測結(jié)果：A：兩種小鼠的模型組與對照組比較，④P<0.001；B：ICR小鼠模型組與C57小鼠模型組比較，①P<0.05，②P<0.01，③P<0.01

2.4Real-time PCR檢測肝纖維化相關(guān)基因：實時熒光定量PCR檢測兩種品系小鼠肝組織中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表達，與對照組比較，兩組CCl4模型組中α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表達均明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而兩組小鼠模型組相比較，ICR小鼠模型組的Fibronectin、α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量上升更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠肝組織Real-time PCR結(jié)果：A：兩種小鼠的模型組與對照組比較，③P<0.001。 B：ICR小鼠模型組與C57小鼠模型組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

肝纖維化的產(chǎn)生是一個極其復(fù)雜的過程，發(fā)病機制主要是多種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的肝星狀細(xì)胞(HSC)以及纖維形成細(xì)胞，導(dǎo)致其生物學(xué)及功能變化，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2-3]。經(jīng)多種臨床研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化發(fā)展的早期階段，去除原發(fā)病因可有效減緩纖維化甚至使其逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)至正常結(jié)構(gòu)，因此，在肝纖維化治療過程中，及時阻斷或延緩纖維化的發(fā)生是肝臟疾病預(yù)后的關(guān)鍵。中醫(yī)藥通過降低肝纖維化大鼠TGF-β/Smads通路和及P-STAT3、P38MAPK、a-SMA的表達從達到改善肝功能，減輕肝損害，抑制肝纖維細(xì)胞個膠原纖維的增生，進而發(fā)揮抗纖維化的作用[4-5]。目前，建立肝纖維化模型的方法大致有腹腔注射CCl4、膽總管結(jié)扎、復(fù)合多因素法和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)等，不同的方法其誘導(dǎo)肝纖維化產(chǎn)生的機制也不同[6-8]。CCl4作為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)性肝毒性物質(zhì)，其簡便、快捷、成功率高的優(yōu)點是建立肝纖維化動物模型是使用最多的方法[9-11]。本實驗通過對肝纖維化模型小鼠肝功能指標(biāo)檢測及肝組織病理學(xué)觀察，對比分析不同種屬之間肝纖維化造模程度的差異，證實在相同的實驗條件下腹腔注射CCl4致小鼠肝纖維化，ICR小鼠對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的造模方式更為敏感，肝纖維化程度明顯高于C57小鼠。