黃文娟， 劉 晶， 陳 良， 軒轅歡

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830000)

黃連(CoptischinensisFranch.)為毛茛科黃連屬多年生草本植物，性味苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效[1]，主要含有生物堿等化學(xué)成分，其中鹽酸小檗堿、巴馬汀堿含量最高[2]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)為姜科姜屬的多年生草本植物的新鮮根莖，性溫，具有開胃止嘔，化痰止咳等功效，化學(xué)成分以姜辣素類和揮發(fā)油為主[4]，其中6-姜酚最具代表性，具有強(qiáng)心、調(diào)節(jié)血管、抗粥樣動脈硬化等作用[5,6]。有研究記載用姜來炮制黃連，能夠降低黃連的苦寒之性，增加和胃止嘔的功效，炮制理論認(rèn)為姜黃連的炮制屬于“以熱治寒”，又稱“反制”[7]。在臨床應(yīng)用中，黃連-姜的配伍組合十分常見，如黃連生姜湯、半夏瀉心湯等，多用于和胃降逆、寒熱平調(diào)、補(bǔ)虛和中、泄熱消痞等[8]。本研究參照臨床常用的6種方劑中黃連-姜的配伍比例，采用了高效液相HPLC法測定配伍前后鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚的含量變化[9]，初步探討了二者“以熱治寒”的配伍原理，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2489型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Q2008型超聲提取儀(上海啟前電子科技有限公司)。

1.2試劑鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定院，批號110715-201212)，巴馬汀堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定院，批號0732-9604)，6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號J-019-151222)，甲醇、乙腈等均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3藥材黃連藥材2017年3月購買于重慶石柱黃連有限公司，生姜、干姜2017年6月購買于新疆新特藥公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)的根莖、姜科植物姜(ZingiberofficinaleRoscoe)的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1黃連-姜的配伍組合依照2015版《中國藥典》選擇6種方劑中黃連-姜的不同配伍比例作為樣品，見表1。

2.2對照品溶液的制備

2.2.1 黃連混合生物堿對照品的制備 稱取鹽酸小檗堿、巴馬汀堿對照品適量，用甲醇溶解制成濃度為0.086 mg/mL鹽酸小檗堿、0.027 mg/mL巴馬汀堿的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品的制備 稱取6-姜酚對照品適量，用甲醇溶解制成濃度為0.441 mg/mL的對照品溶液，備用。

表1 臨床上6種不同方劑組合中黃連-姜的配伍

2.3供試品溶液的制備

2.3.1 黃連供試品溶液的制備 稱取生黃連粉末、1～6的樣品粉末各0.1 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)混合溶液50 mL，密塞稱重，超聲提取50 min，放至室溫再稱重，用甲醇補(bǔ)重，搖勻、濾過，取濾液即得。

2.3.2 姜供試品溶液的制備 稱取生姜2.0 g、干姜0.5 g、樣1～6的樣品各3.0 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，回流提取30 min，放至室溫再稱重，用甲醇補(bǔ)重、搖勻、濾過，取濾液即得。

2.4色譜條件

2.4.1 黃連生物堿色譜條件 symmetry shield C18柱色譜柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-(磷酸∶三乙胺∶水=1∶2∶100)(24∶76)，檢測波長265 nm，流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，見圖1、2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖2 樣品1HPLC色譜圖

2.4.2 6-姜酚色譜條件 symmetry shield C18色譜柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-甲醇-水(40∶5∶55)，檢測波長280 nm，流速為1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，見圖3、4。

圖3 6-姜酚HPLC色譜圖

圖4 樣1HPLC色譜圖

2.5回歸方程的建立分別吸取“2.2.1”項下鹽酸小檗堿、巴馬汀堿混合標(biāo)準(zhǔn)品5、10、20、40、80 μL進(jìn)樣，分別吸取“2.2.2”項下6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品2、4、6、8、40 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值(Y)為濃度X(μg/μL)進(jìn)行回歸處理，得到鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚的回歸方程，見表2。

表2 鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚回歸方程的建立

2.6方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 分別吸取“2.2”項下的對照品溶液各10 μL，按“2.4”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別吸取“2.2”項下的對照品溶液10 μL，按“2.4”項下色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚峰面積的RSD分別為1.1%、1.0%、1.9%，表明供試品溶液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取樣品1共12份，分別按“2.3.1”“2.3.2”項下制備供試品各6份，按“2.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果鹽酸小檗堿、巴馬汀堿、6-姜酚含量的RSD分別1.3%、1.7%、2.0%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.3.1”“2.3.2”項下制備供試品各6份，分別加入一定量的鹽酸小檗堿、巴馬汀堿混合對照品和6-姜酚對照品，按“2.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算平均加樣回收率。鹽酸小檗堿、巴馬汀堿混合對照品和6-姜酚對照品的平均加樣回收率分別為98.14%、99.02%、99.73%，見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7樣品的含量測定取“2.3”項下供試品溶液，按“2.4”項色譜條件進(jìn)樣測定，以△鹽酸小檗堿、△巴馬汀堿、△總生物堿、△6-姜酚表示配伍前后成分的含量差值，對應(yīng)樣1～6黃連-姜的比例進(jìn)行比較，見表4。

表4 黃連-姜中成分的含量測定結(jié)果

注∶與生黃連相比，△P<0.05；與生姜相比，◆P<0.05；與干姜相比,▲P<0.05。

表5 樣1～6黃連-姜的配伍前后成分的含量差異(mg/g)

3 討論

3.1試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析本研究發(fā)現(xiàn)，隨著姜類物質(zhì)在黃連配比使用中的增加，鹽酸小檗堿的溶出逐漸增加，巴馬汀堿、6-姜酚的含量有所降低，而對于總生物堿是有所增加的，這就證明了姜類物質(zhì)能夠增加生物堿的溶出。

3.2化學(xué)角度分析黃連中生物堿易溶于水，呈堿性，而6-姜酚分子結(jié)構(gòu)中的羧基、羥基容易斷裂形成醛和酚，故姜酚的分子中具有一般酚羥基、羧基的共性[10]，6-姜酚利用自身的酸性將黃連中更多的生物堿游離出來，這與本研究的試驗(yàn)結(jié)果也是相吻合的。

3.3炮制原理分析生物堿是黃連抗菌、消炎、抗腫瘤的主要化學(xué)成分[11,12]，而6-姜酚是姜的辣味成分,也是其主要的活性成分[13]。在黃連-姜的配伍使用中，溫?zé)嵝缘乃幬锝梢跃徑恻S連的苦寒之性，同時又能夠增加黃連總生物堿的溶出，這就是炮制學(xué)中的“以熱治寒”、 “增效減寒”的原理[14]，即黃連-姜配伍使用后，苦寒之性降低并擴(kuò)大了黃連治病的范圍，符合臨床用藥需求。對于具體臨床療效的改變，可以通過進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)合本研究的成分變化進(jìn)行對比分析。

本研究單純對臨床常用方劑中黃連-姜的比值進(jìn)行了研究，而在實(shí)際應(yīng)用中黃連-姜的配伍多與其他中藥以復(fù)方制劑形式存在，這就增加了其他成分的干擾，組方的不一致也可能造成黃連、姜的成分含量變化，所以本次試驗(yàn)結(jié)果可以作為對比含有黃連-姜的復(fù)方制劑的研究提供基礎(chǔ)。