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        羥基紅花黃素A對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺組織的保護作用及機制

        2018-10-26 05:33:30王濤劉宏祥齊姣史小盼王珍劉一閆麗靜
        山東醫(yī)藥 2018年37期
        關(guān)鍵詞:組肺右肺肺泡

        王濤,劉宏祥,齊姣,史小盼,王珍,劉一,閆麗靜

        (河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北保定071000)

        腦卒中作為常見的心腦血管疾病,不僅能夠引起腦組織損傷,還會導(dǎo)致遠隔重要臟器損傷,其中尤以合并肺部感染最為常見。據(jù)報道,腦卒中后肺炎的發(fā)生率高達20%,是與腦卒中死亡有關(guān)的重要危險因素,嚴重威脅患者生命健康[1]。腦卒中可引起炎癥反應(yīng)失調(diào),導(dǎo)致肺組織內(nèi)炎性細胞募集,使肺組織內(nèi)炎癥介質(zhì)過度分泌,最終引起肺組織損傷。因此,改善腦卒中后誘發(fā)肺部炎癥的關(guān)鍵在于控制肺組織炎癥反應(yīng)。然而,目前尚缺乏具有明確療效的靶向藥物。羥基紅花黃色素A(HSYA)具有較強的抗炎作用[2,3],然而,其對腦卒中相關(guān)性肺炎(SAP)的作用尚不清楚。2016年8月~2017年5月,本研究采用HSYA對SAP大鼠進行治療,探究其對大鼠肺組織損傷的改善作用,并初步探討其作用機制,以期為該病的治療提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 動物、試劑及儀器 50只SPF級健康成年雄性SD大鼠購自北京生命科學(xué)研究所,體質(zhì)量280~320 g,8~10周齡,合格證號:YXK(京)2015-0002。HSYA純品購自成都康邦生物科技有限公司,純度為89.5%。Janus激酶(JAK2)特異性抑制劑N-芐基-3,4-二羥基亞芐基氰基乙酰胺(AG490)購自美國Sigma-Aldrich公司;正常山羊血清、封閉液購自美國Gibco公司;p-JAK2、磷酸化的信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB) p65抗體購自美國Sigma-Aldrich公司;腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-18酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、核提取試劑盒、蛋白提取試劑盒購自美國Rche公司。低溫調(diào)整離心機購自德國Eppendorf公司;電子天平購自德國Sartorius公司;倒置顯微鏡、熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

        1.2 SAP模型制備 將SD大鼠隨機選取10只作為假手術(shù)組,其余大鼠制備SAP模型。根據(jù)參考文獻[4],采用四動脈阻斷法制備急性全腦缺血再灌注致腦-肺綜合征大鼠模型。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將其仰臥固定于固定板上,沿腹正中線切1 cm切口,暴露頸總動脈并分離。用棉線環(huán)頸總動脈成1 cm線環(huán)后,縫合切口。將大鼠轉(zhuǎn)移至立體定位儀,俯臥固定,于枕骨下沿背正中切1 cm切口,暴露第1頸椎橫突翼小孔后,將注射器針頭搗入小孔,旋轉(zhuǎn)針體至有鮮血溢出,即說明椎動脈損毀,維持2~3 min后,止血。椎動脈永久阻斷后縫合切口。假手術(shù)組僅暴露第1頸椎和頸總動脈,不阻斷血管。術(shù)后即刻腹腔注射青霉素8萬U,1次/d,持續(xù)3 d。模型廢棄標(biāo)準(zhǔn):大鼠四肢上舉,翻正反射、痛覺反應(yīng)消失,瞳孔散大,眼球灰白色,在灌注期內(nèi)意識未恢復(fù);在缺血期死亡或昏睡,在整個實驗過程中出現(xiàn)抽搐。造模48 h內(nèi)觀察大鼠進食減少、飲水增多、毛色灰暗、背部弓起、耳緣靜脈突起加粗,并伴有眼球變濁暗淡等癥狀,同時肺部聽診可聞及雜音,且呼吸急促,則判定為造模成功。將大鼠仰臥固定,重新打開頸部切口,以動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈阻斷30 min后松開動脈夾,再灌注3 h。

        1.3 HSYA治療方法及標(biāo)本采集 將造模成功的SAP模型大鼠隨機分為4組各10只:SAP組、AG490組、低劑量HSYA組(L-HSYA組)和高劑量HSYA組(H-HSYA組)。根據(jù)參考文獻[5,6]對大鼠進行藥物治療。AG490組經(jīng)尾靜脈注射AG490 5 mg/kg,L-HSYA組和H-HSYA組分別經(jīng)尾靜脈注射低劑量(8 kg/mg)、高劑量(16 kg/mg)HSYA,假手術(shù)組、SAP組經(jīng)尾靜脈注射等劑量生理鹽水,均1次/d,連續(xù)給藥7 d。末次給藥后6 h,各組經(jīng)腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉,迅速于左肺進行支氣管肺泡灌洗;切除右肺上葉組織,將其洗滌后固定于4%多聚甲醛中,進行組織病理學(xué)檢查;取右肺中葉以測算肺組織濕/干重量比(W/D);切除右肺下葉組織,于-80 ℃凍存?zhèn)錂z。

        1.4 肺組織病理學(xué)觀察 將切除的右肺上葉組織固定于4%多聚甲醛中24 h,石蠟包埋,制備5 μm厚切片。脫蠟后,將連續(xù)切片用HE染色后,于顯微鏡下進行組織病理學(xué)檢查,以400倍視野收集圖像。根據(jù)參考文獻[7],采用半定量評分系統(tǒng)評估肺組織病理學(xué)嚴重程度,包括肺泡充血、出血,白細胞浸潤,肺間質(zhì)水腫,肺泡壁厚度等,每項評分0~4分,共20分。分值越高表示肺組織病理變化越嚴重。

        1.5 肺組織W/D值測算 將切除的右肺中葉進行測量,記錄W值;之后將右肺中葉置于110 ℃烤箱烘干,24 h后測量,記錄D值。

        1.6 肺組織中髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 右肺下葉組織解凍后用50 mmol/L Tris-HCL 1 mL勻漿,與鈉緩沖液混勻后離心。收集沉淀重懸于磷酸鉀緩沖液中,根據(jù)說明書,采用MPO檢測試劑盒檢測MPO活性。在37 ℃反應(yīng)體系中1 g肺組織分解1 μmol過氧化氫記作1個活力單位(U/g)。

        1.7 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細胞因子檢測 大鼠麻醉后,以血管夾夾閉右肺門后,于左肺用冷PCS進行支氣管肺泡灌洗,共灌洗5次,收集BALF,于4 ℃ 3 000 r/min離心15 min,收集上清液。采用TNF-α、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒,根據(jù)說明書檢測BALF中各炎性細胞因子水平。

        1.8 肺組織核提取物中NF-κB結(jié)合活性檢測 采用核提取試劑盒,根據(jù)說明書從肺組織中提取核蛋白。使用TransAM NF-κB試劑盒測量 p65 DNA結(jié)合活性。

        1.9 肺組織核提取物中NF-κB p65蛋白表達檢測 采用Western blotting法。使用RIPA裂解緩沖液,根據(jù)說明書從肺組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。4 ℃下將膜與p-JAK2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)的一抗和β-actin(1∶5 000)孵育過夜。洗滌后與辣根過氧化物酶綴合的二抗一起溫育。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影后,用Quantity One軟件分析蛋白相對表達量。

        2 結(jié)果

        2.1 各組肺組織病理變化比較 SAP組可觀察到微小肺血管和肺泡隔膜毛細血管的擴張,肺胞腔變窄、肺泡壁增厚,部分肺泡受損,肺泡隔變寬,肺胞及肺間質(zhì)組織中可見明顯的白細胞浸潤,并伴有充血、出血和肺間質(zhì)水腫。與SAP組比較,AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺組織病理變化均改善。假手術(shù)組、SAP組、AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺損傷評分分別為(2.62±0.76)、(15.33±2.26)、(4.34±1.15)、(9.68±2.13)、(5.01±1.36)分。與假手術(shù)組比較,SAP組肺損傷評分高(P<0.05);與SAP組比較,AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺損傷評分低(P均<0.05);與AG490組、H-HSYA組比較,L-HSYA組肺損傷評分高(P均<0.05);AG490組與H-HSYA組肺損傷評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        2.2 各組大鼠W/D值比較 假手術(shù)組、SAP組、AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組W/D值分別為4.13±1.10、8.92±1.87、5.65±0.98、7.08±1.24、6.10±1.17。與假手術(shù)組比較,SAP組肺組織W/D值高(P<0.05);與SAP組比較,AG490組、L-HSYA組和H-HSYA組肺組織W/D值低(P均<0.05);與AG490組、H-HSYA組比較,L-HSYA組肺組織W/D值高(P均<0.05);AG490組與H-HSYA組肺組織W/D值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        2.3 各組MPO活性、炎癥因子水平比較 見表1。

        表1 大鼠BALF中炎癥因子水平比較

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與SAP組比較,#P<0.05;與AG490組比較,&P<0.05;與L-HSYA組比較,△P<0.05。

        2.4 各組肺組織核提取物中NF-κB活性比較 見表2。

        表2 各組肺組織核提取物中NF-κB活性比較

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與SAP組比較,#P<0.05;與AG490組比較,&P<0.05;與L-HSYA組比較,△P<0.05。

        2.5 各組肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達比較 見表3。

        表3 各組肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達比較

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與SAP組比較,#P<0.05;與AG490組比較,&P<0.05;與L-HSYA組比較,△P<0.05。

        3 討論

        HSYA是從傳統(tǒng)中藥紅花中提取的黃色色素的主要活性化學(xué)成分,屬于一種新型的查耳酮糖苷。HSYA具有顯著的心腦血管保護作用,且與其抗氧化損傷和抗炎作用有關(guān)[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn),HSYA治療能夠改善SAP大鼠肺組織病理學(xué)損傷和肺水腫,提示HSYA能夠減輕SAP大鼠肺組織炎癥反應(yīng)。然而,HSYA對肺組織炎癥性損傷改善的作用機制尚不清楚。

        本研究采用改良四動脈阻斷法制備全腦缺血再灌注致腦-肺綜合征模型,發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注損傷大鼠肺組織表現(xiàn)出明顯的病理學(xué)改變,包括白細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫、肺泡充血、肺泡腔變窄、肺泡壁增厚等;大鼠肺W/D值升高,說明發(fā)生嚴重肺水腫。該模型大鼠出現(xiàn)嚴重肺組織炎癥損傷和明確的肺組織病理改變。因此,改善腦卒中后誘發(fā)的肺損傷關(guān)鍵在于控制肺組織炎癥反應(yīng)。

        肺泡巨噬細胞是肺組織中最豐富的先天性免疫細胞,通過產(chǎn)生過量的TNF-α、IL-1β、IL-18等促炎性細胞因子,引起炎癥反應(yīng)[10]。動物研究發(fā)現(xiàn),IL-18和IL-1β中合抗體的應(yīng)用能夠減輕急性肺損傷動物模型中的肺損傷[11]。另外,研究發(fā)現(xiàn),IL-1β、TNF-α等細胞因子表達上調(diào)能夠進一步促進嗜中性粒細胞的浸潤至損傷肺組織中,加重肺組織炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)[12]。中性粒細胞浸潤是與肺炎癥性損傷有關(guān)的關(guān)鍵因素[13]。MPO是中性粒細胞浸潤的標(biāo)志物。研究證實,中性粒細胞的消除能夠顯著降低動物模型中的肺損傷嚴重程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠肺BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平升高,且肺組織MPO活性增加,進一步證實SAP大鼠肺組織炎性損傷。研究表明,HSYA能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的TNF-α等炎性細胞因子的表達,從而發(fā)揮抗炎作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)HSYA治療后,肺BALF中炎癥細胞因子水平均顯著降低,且MPO活性降低,提示HSYA可能通過減少肺組織中炎癥細胞因子分泌,抑制肺組織中性粒細胞浸潤,從而減輕肺組織炎癥反應(yīng),緩解肺組織損傷。

        NF-κB是能特異性結(jié)合免疫球蛋白κ輕鏈基因10 bp堿基序列,并促進κ基因表達的核蛋白。NF-κB是促炎性轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)過程中引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。細胞內(nèi)外多種刺激信號能夠激活NF-κB,使活化的NF-κB從細胞質(zhì)中快速轉(zhuǎn)移至細胞核中,與誘導(dǎo)型基因啟動序列中的特定κB位點結(jié)合,進而誘導(dǎo)編碼炎性細胞因子、趨化因子、黏附分子等基因的表達,從而引起細胞和組織損傷,參與多種疾病的病理生理過程。研究表明,NF-κB的高表達能夠通過誘導(dǎo)炎性細胞因子TNF-α的表達而參與炎癥性肺損傷的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn),SAP組肺組織中NF-κB活性增加,且NF-κB蛋白表達水平升高,提示NF-κB的活化與SAP大鼠肺組織炎癥損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),HSYA能夠通過抑制NF-κB活化減輕炎癥反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),HSYA能明顯降低NF-κB活性及蛋白表達水平。提示,HSYA可能通過抑制NF-κB活化,抑制炎性細胞因子表達,從而改善肺組織損傷。

        JAK/STAT信號通路是一種具有干擾素樣作用的細胞內(nèi)信號途徑。JAK家族包括四個激酶成員,JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2。AG490是特異的JAK酪氨酸磷酸化抑制劑,能夠有效阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并抑制STAT的激活[18]。STAT是JAK的下游底物,是細胞質(zhì)中的一種轉(zhuǎn)錄因子,能夠與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的特定DNA序列結(jié)合。JAK/STAT信號通路能夠通過介導(dǎo)細胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-18等多種細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細胞因子直接負責(zé)將刺激信號轉(zhuǎn)移至細胞核,并促進基因轉(zhuǎn)錄,從而參與調(diào)節(jié)多種病理生理過程(免疫應(yīng)答、細胞增殖分化、細胞凋亡、炎癥和癌癥等)。已有研究證實,JAK/STAT信號通路激活在肺組織損傷中發(fā)揮重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn),SAP大鼠肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達升高,提示JAK2/STAT3信號通路的激活參與肺炎癥性損傷。而HSYA能夠抑制JAK2/STAT3信號通路活化。過往研究證實,JAK/STAT信號通路激活能夠促進NF-κB活化,從而誘導(dǎo)或增強炎癥反應(yīng)[5]。本研究發(fā)現(xiàn),JAK2/STAT3特異性抑制劑AG490能夠抑制NF-κB活化和p65的核易位,與過往研究一致。經(jīng)HSYA治療后,SAP大鼠肺組織NF-κB的活化被抑制,與AG490作用效果一致。結(jié)合過往研究推測,HSYA通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活,進一步抑制NF-κB活化,參與調(diào)控肺組織炎癥反應(yīng)。

        肺組織中JAK/STAT信號通路能夠被多種因素激活,包括炎癥、缺血、缺氧等。研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子通過使STAT3磷酸化,擴大炎癥反應(yīng),進一步促進炎性細胞釋放促炎細胞因子,加重肺損傷[20]。徐志紅等[21]發(fā)現(xiàn),SAP大鼠肺組織內(nèi)p-JAK2、p-STAT3表達上調(diào)與IL-1β、TNF-α水平上調(diào)一致,證實JAK2/STAT3信號通路的激活能夠促進炎性細胞因子釋放,從而進一步加重肺損傷。結(jié)合過往研究推測,HSYA能夠抑制肺組織中JAK2/STAT3信號通路激活,減少炎癥細胞因子分泌,同時抑制NF-κB活化及核易位,從而進一步抑制炎癥細胞因子相關(guān)基因的表達,最終抑制肺組織中炎性細胞浸潤,緩解肺組織損傷。

        綜上所述,HSYA對SAP大鼠的炎癥性肺損傷具有改善作用,這可能與其抑制肺組織中JAK2/STAT3信號通路激活有關(guān)。然而,本研究中HSYA僅能部分緩解肺組織損傷及炎癥反應(yīng),而非完全逆轉(zhuǎn)SAP大鼠的肺損傷,這可能與藥物劑量有關(guān),也有可能是由于SAP中的肺組織損傷不僅與炎癥有關(guān),還與其他因素有關(guān)。后續(xù)研究還需深入探討,以期為疾病治療提供更充分的依據(jù)。

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