秦松林，劉婷，胡威，劉伯龍，唐正，馮聚玲，譚靖（.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿男科，湖南衡陽(yáng)00；.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)中心，湖南衡陽(yáng)00；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室，湖南衡陽(yáng)00；.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院泌尿外科，湖南長(zhǎng)沙003）

腎細(xì)胞癌（RCC）是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，占腎臟腫瘤的 85％～90％[1?2]。腎臟不容易受創(chuàng)傷，但是當(dāng)腎臟出現(xiàn)病變時(shí)也不容易被發(fā)現(xiàn)。另外，RCC在臨床癥狀上又缺乏特異性。近50％的RCC患者在早期是無(wú)任何臨床癥狀的，臨床上大部分患者通過(guò)體檢或檢查其他疾病時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。

轉(zhuǎn)移性RCC采用以內(nèi)科治療為主的綜合性治療，但療效欠佳[3]。目前還缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)RCC，所以早期預(yù)測(cè)RCC還有較大的困難。因此，篩選RCC發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)RCC、有效防治RCC具有非常重要的意義。

細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，具有重要的病理生理意義。凋亡失調(diào)是許多疾病的發(fā)病機(jī)制之一，所以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，可以防治這些疾病。目前，在所發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中，存活素（Survivin）的功能最強(qiáng)大。其不但具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，而且還有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用。Survivin基因位于17q25染色體上，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)大約有14 700個(gè)堿基對(duì)。

研究表明，在人類胚胎發(fā)育的組織中和大多數(shù)的惡性腫瘤組織當(dāng)中都有Survivin的表達(dá)，包括胃癌、膀胱癌等，而其在正常成熟組織中表達(dá)陰性，具有腫瘤特異性表達(dá)的特點(diǎn)[4]。目前，有關(guān)Survivin的研究已成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法從mRNA水平上檢測(cè)RCC組織和正常腎組織中Survivin的表達(dá)。本文探討Survivin與RCC的相關(guān)性，期待為早期發(fā)現(xiàn)RCC，并且為判斷RCC惡性程度提供新手段。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 在2010年3月至2011年9月中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院泌尿外科收治的RCC患者中隨機(jī)挑選出63例，將其手術(shù)切除的RCC標(biāo)本作為研究組，另取其相應(yīng)的遠(yuǎn)離腫瘤組織的正常腎組織作為對(duì)照組，取自距離腫瘤組織5 cm以上。63例患者中男36例，女27例；年齡28～75歲，平均（54.0±8.3）歲。所有患者均行 RCC 根治術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)均為RCC。臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期35例[參照《2011版中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》中推薦采用的2002年美國(guó)腫瘤研究聯(lián)合委員會(huì)（ATCC）腎癌臨床分期方法]；病理分級(jí)：高分化30例，中分化21例，低分化12例[參照《2011版中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》中推薦采用的2004年世界衛(wèi)生組織（WHO）病理分級(jí)方法]。將最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RCC各臨床病例參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR引物（英韋創(chuàng)津生物公司，廣州，中國(guó)），DNA Marker，RevertAidTM First Strand cDNA 合成試劑盒（Fermentas，Maryland，USA）；PCR熱循環(huán)儀、低溫微量離心機(jī)（Eppendorf，Hamberg，Germany）。

1.2 方法 采用熒光定量PCR，提取2組RCC組織和癌旁正常組織總RNA，并用DNA酶Ⅰ處理后進(jìn)行定量分析，2組取等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。具體程序如下：預(yù)變性95℃，30 s，20℃，1個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng) 95℃，5 s，20℃，60℃，34 s，20℃，40個(gè)循環(huán)，72℃，34 s，20℃，40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以人胚腎細(xì)胞系HEK293為參照細(xì)胞系，β?actin 作為內(nèi)參基因，根據(jù)通用的 2?△△CT方法，Survivin△CT∕β?actin△CT 計(jì)算樣本中 Survivin 的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組RCC組織和正常腎組織中Survivin mRNA表達(dá)情況比較 研究組RCC組織中Survivin mRNA高表達(dá)陽(yáng)性51例（80.95％）。對(duì)照組正常腎組織中未發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA高表達(dá)陽(yáng)性。Survivin mRNA在研究組RCC中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組正常腎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 2組RCC組織和正常腎組織中Survivin mRNA表達(dá)情況比較

2.2 不同臨床分期RCC中Survivin mRNA表達(dá)情況比較 Survivin mRNA在Ⅲ、Ⅳ期RCC中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期RCC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床分期RCC中Survivin mRNA表達(dá)情況比較

2.3 不同病理分級(jí)RCC中Survivin mRNA表達(dá)情況比較 Survivin mRNA在低、中分化RCC中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化RCC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理分級(jí)RCC中Survivin mRNA表達(dá)情況比較

2.4 Survivin mRNA在RCC中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 Survivin mRNA在35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽(yáng)性表達(dá)30例（85.71％），在28例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽(yáng)性表達(dá)15例（53.57％）。Survivin mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 RCC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 Survivin mRNA在RCC中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

篩選RCC發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物對(duì)早期發(fā)現(xiàn)RCC，進(jìn)而早期診治RCC具有非常重要的意義。在已知多種癌前病變中，均有Survivin的表達(dá)。包括結(jié)腸息肉、乳腺腺瘤、博文氏病、肥厚性光化性角化病[5]。

王克文等[6]使用熒光定量PCR法檢測(cè)38例食管癌中 Survivin mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Survivin mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為73.68％，且與腫瘤惡性程度有關(guān)，而與食管鱗癌患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著性關(guān)系。在惡性黑色素瘤的基因表達(dá)上，有許多角色參與調(diào)控其細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)。作為凋亡相關(guān)基因，Survivin在惡性黑色素瘤細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均可以被檢測(cè)出，而在良性或發(fā)育不良痣上無(wú)表達(dá)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的核表達(dá)可以預(yù)測(cè)惡性黑色素瘤的復(fù)發(fā)[8]。Sur?vivin表達(dá)與膀胱腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)有著密切關(guān)系，并且是早期復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因子。李守賓等[9]用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了45例前列腺惡性腫瘤組織和50例良性前列腺組織中Survivin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在45例前列腺癌組織中，共有37例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為82.2％；在50例良性前列腺組織中，僅有6例表達(dá)陽(yáng)性。其中在前列腺癌組織中，Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度與Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，即在Gleason低分化組中的表達(dá)顯著低于高分化組。WANG等[10]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)24例RCC組織中的Survivin水平，結(jié)果顯示Survivin的表達(dá)與腫瘤的惡性程度、分級(jí)、分期、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

本研究采用熒光定量PCR法檢測(cè)腎組織中的Sur?vivin mRNA水平表達(dá)，結(jié)果顯示，63例RCC組織中Survivin mRNA高表達(dá)陽(yáng)性為51例（80.95％），正常組織未發(fā)現(xiàn)mRNA陽(yáng)性表達(dá)。本研究通過(guò)mRNA水平證實(shí)了Survivin在RCC中的高表達(dá)，在正常腎組織中不表達(dá)。通過(guò)本研究結(jié)果可以看出，Survivin只選擇性高表達(dá)于RCC組織中，而在正常腎組織中的表達(dá)為陰性。在RCC的發(fā)展與演變過(guò)程中，Survivin可能起到了舉足輕重的作用。

進(jìn)一步研究Survivin的表達(dá)與RCC的關(guān)系，Sur?vivin mRNA在中、低分化RCC表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于高分化RCC。Survivin mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中高表達(dá)陽(yáng)性。這表明Survivin的表達(dá)與RCC的惡性程度有密切關(guān)系，可能參與了RCC的臨床進(jìn)展。

Survivin是RCC一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與RCC的復(fù)發(fā)、預(yù)后密切相關(guān)。在RCC的各個(gè)時(shí)期均能夠檢測(cè)出Survivin的陽(yáng)性表達(dá)，可以認(rèn)為Survivin可能在RCC發(fā)生早期中起作用，在胰腺癌、結(jié)腸癌中同樣有類似的研究 [11?12]。

綜上所述，Survivin有望成為判斷RCC轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，將有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。