陳 思，張雪芳，肖 瓊,2,3，陳艷紅,2,3，倪 輝,2,4，肖安風,2,3,4,

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021；4.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

豆粕是大豆提取豆油后的殘渣再經(jīng)過適度加工得到的副產(chǎn)品[1]，是目前飼料行業(yè)中使用范圍較廣的一種優(yōu)質植物性蛋白飼料源[2]。豆粕蛋白質質量分數(shù)在40%以上，但是分子質量大、結構緊密，導致消化利用率不高[3]。在適宜的條件下添加蛋白酶制劑，將大分子蛋白質降解成小分子蛋白質、小肽和氨基酸，從而使蛋白質分子質量降低[4]，具有低抗原性，更易于吸收，可大大提高蛋白質的利用率[5]。李樹品等[6]選用中性蛋白酶酶解豆粕，蛋白質消化率可達70%以上，并適當添加纖維素酶和α-淀粉酶后，對提高蛋白質消化率有利。李磊等[7]對大豆餅粕進行中性蛋白酶和酸性蛋白酶雙酶聯(lián)合水解處理，探索出了最適工藝條件：先加中性蛋白酶，溫度為40 ℃，pH=8.0，料水比(m/V)為1∶9，加酶量為7%，水解6 h，后加酸性蛋白酶，溫度為45 ℃，pH=3.0，加酶量為3%，水解8 h，蛋白質水解度可達42.2%。

蛋白酶系對非淀粉多糖如纖維素、棉籽糖、水蘇糖等不起作用，而此成分在豆粕中占較大比例(約20%)，在動物消化道內結合大量水，阻礙營養(yǎng)物質的消化利用[8]。所以，必須添加適宜的酶制劑降解這些抗營養(yǎng)因子，降低對動物消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的傷害[9]。何中山[10]研究得出：應用中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和β-甘露聚糖酶酶解豆粕，酶解后產(chǎn)品中還原糖為8.2%，蛋白質水解度為4.5%。為了解決豆粕中所含的蛋白質分子質量較大、動物對其利用率相對較低、一些抗營養(yǎng)因子限制了豆粕的使用[11]等問題，本文采用單因素試驗設計，探究蛋白酶和非淀粉多糖(non-starch polysaccharide,NSP)酶復合添加、反應時間對豆粕中蛋白質水解度、還原糖釋放量、總糖含量的影響，對酶解豆粕品質進行評價，從而提高其利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶均購自和氏璧生物技術有限公司；豆粕購自廈門夏商淘化大同食品有限公司，質量符合GB/T 19541—2004規(guī)定：顆粒40目，色澤呈淺黃色，具有烤大豆香味，沒有酸敗、霉變、焦化等異味，均勻流動性好，呈不規(guī)則碎片狀，不含過量雜質，粗蛋白質量分數(shù)為46.2%。

甲醛、濃硫酸、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；苯酚、3，5-二硝基水楊酸、鄰苯二甲酸氫鉀均為分析純，購自西隴化工股份有限公司。

1.2 豆粕酶解工藝

1.2.1 酶添加量對豆粕品質的影響

將20 g豆粕裝于250 mL三角瓶中密封，121 ℃、高壓滅菌20 min，冷卻后加入中性蛋白酶，設定料水比(m/V)為1∶1，溫度為45 ℃，酶解時間為48 h，研究不同加酶量對豆粕品質的影響；添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，研究其對豆粕品質的影響；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶和不同用量的纖維素酶，研究其對豆粕品質的影響；添加30 U/g中性蛋白酶、50 U/g酸性蛋白酶、50 U/g纖維素酶和不同用量的木聚糖酶，研究其對豆粕品質的影響。

1.2.2 酶解時間對豆粕品質的影響

添加30 U/g的中性蛋白酶到裝有20 g豆粕的250 mL三角瓶中，料水比(m/V)為1∶1，攪拌均勻，置于45 ℃恒溫搖床中，研究酶解時間(12,24，36，48，60，72 h)對豆粕的影響；固定以上酶解條件，添加30 U/g的中性蛋白酶和50 U/g的酸性蛋白酶，研究2種酶共同作用時不同酶解時間對豆粕品質的影響；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶和50 U/g的纖維素酶，研究3種酶共同作用時不同酶解時間對豆粕品質的影響；添加30 U/g的中性蛋白酶、50 U/g的酸性蛋白酶、50 U/g的纖維素酶和50 U/g的木聚糖酶，研究4種酶共同作用時不同酶解時間對豆粕品質的影響。

1.3 主要檢測指標和分析方法

1.3.1 感官評價

參照國標GB 21172—2007[12]和農業(yè)行業(yè)標準NYT 2218—2012[13]的規(guī)定以及陳萱等[14]使用的感官分析方法并有所改進。設定在光線正常及無異味的環(huán)境下，將適量各種酶解豆粕樣品倒入干凈的玻璃容器中，通過目測、鼻嗅、手感分別評定樣品的顏色、氣味和質地，具體標準見表1。

表1 酶解豆粕感官評價標準表Tab.1 Sensory evaluation of soybean meal enzymolysis

1.3.2 pH值的測定

取各個酶解豆粕樣品l.0 g，加蒸餾水50 mL，于搖床上180 r/min振蕩20 min，過濾，測上清液pH值。

1.3.3 蛋白質水解度的測定

蛋白質水解度測定采用甲醛滴定法[15-16]：稱取5 g樣品，加入50 mL煮沸冷卻的蒸餾水，磁力攪拌30 min，調整pH值為8.2，量取20 mL質量分數(shù)37%中性甲醛溶液加入到水解液中，持續(xù)攪拌，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，當pH=9.2時記錄消耗的堿液體積。蛋白質水解度(degree of hydrolysis,DH)計算公式為：DH/%=(c×V×1.400 8)/(m×7.8)×100，式中：DH為蛋白質水解度(%)；c為NaOH溶液濃度(mol/L)；V為NaOH溶液消耗體積(mL)；1.400 8為1 mL 0.1 mol/L NaOH相當?shù)牡?；m為樣品的質量(g)；7.8為每克原料蛋白質肽鍵的物質的量(mmol)。

1.3.4 還原糖含量的測定

還原糖含量測定采用DNS法[17]：稱取0.1 g樣品，加入30 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌溶解20 min后3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL加DNS溶液混勻后于沸水浴顯色5 min，冷卻后加蒸餾水補足體積至10 mL，再次混合均勻后于波長540 nm處測吸光度值。每組做3個平行，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算得到樣品中還原糖含量。

總糖含量采用硫酸-苯酚法測定[18]：取1 g樣品加入15 mL纖維素酶液(pH=5.5)，60 ℃下振蕩水浴1 h，離心、過濾，取上清液適當稀釋后，取2 mL稀釋液與1 mL質量分數(shù)6%苯酚混勻，快速加入濃硫酸5 mL，混勻，室溫條件下靜置30 min，每組做3個平行，于波長490 nm處測吸光度值。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算得到樣品中總糖含量。總糖得率/%=(X×D/m)×100，式中：X為樣品溶液的葡萄糖質量(μg)；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質量(μg)。水解度/%=還原糖釋放量/總糖含量×100。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝對豆粕品質的影響

2.1.1 中性蛋白酶添加量對豆粕品質的影響

參考李樹品等[6]用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比為1∶10、pH=7.5、溫度為40 ℃條件下水解64～72 h，得到的蛋白質消化率≥70%。采用中性蛋白酶水解豆粕，在料水比為1∶1、溫度為45 ℃條件下水解48 h，考察其添加量對豆粕品質的影響。結果(見圖1)表明，加酶量達到30 U/g后，感官品質不再變化；加酶量對pH值無明顯影響；30 U/g時蛋白質水解度最高可達20.7%；總糖質量分數(shù)隨著酶量增加而上升，70 U/g時最高為8.5%，還原糖的釋放量和水解度變化不明顯,說明中性蛋白酶對還原糖分解作用不大。綜上，將中性蛋白酶的添加量確定為30 U/g。

2.1.2 酸性蛋白酶添加量對豆粕品質的影響

參考李磊等[7]在pH=8.0、料液比為1∶9、溫度為40 ℃的條件下加入質量分數(shù)7%中性蛋白酶作用6 h，后調pH=3.0，45 ℃下加入質量分數(shù)5%酸性蛋白酶作用8 h，蛋白質水解度達到了44.2%，以料水比為1∶1，溫度為45 ℃，酶解時間為48 h，添加30 U/g中性蛋白酶和不同用量的酸性蛋白酶，確定適宜添加量。由圖2可見，加入酸性蛋白酶后，豆粕氣味由單一的醬香味轉變?yōu)闈夂竦拇枷阄叮籶H值都接近于8.4，與單酶水解時比較，pH值上升，但是酸性蛋白酶適宜的pH值范圍為2.5～6.0，可能發(fā)揮不出酸性蛋白酶的優(yōu)勢；酸性蛋白酶添加量30 U/g以上，蛋白質水解度20%左右，與單酶蛋白質水解度相比沒有提升；總糖質量分數(shù)明顯提高， 50 U/g時為最小值也達到了18.2%；但還原糖質量分數(shù)變化幅度較小，僅提高了0.3%，說明非淀粉多糖需要加入特定的酶(NSP酶)才能水解。綜上，確定酸性蛋白酶的添加量為50 U/g。

2.1.3 纖維素酶添加量對豆粕品質的影響

考慮到蛋白酶系對非淀粉多糖不起作用，而此成分又在豆粕中占較大比例(約20%)，在動物消化道內可結合大量水，阻礙營養(yǎng)物質的消化利用，所以必須添加適宜的酶制劑分解[8]。其中豆皮主要是粗纖維，細胞壁中也含有纖維素，故NSP酶可選纖維素酶。高紅巖等[19]利用纖維素酶制劑降解豆粕中的纖維素，以提高豆粕蛋白質水溶出率，加入蛋白酶和纖維素酶后蛋白質水溶出率達到76.2%，比僅以蛋白酶水解豆粕的蛋白質水溶出率(67.8%)高，說明通過降解纖維素可提高豆粕蛋白質的溶出率。

添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶后考察纖維素酶添加量對豆粕品質的影響，結果見圖3。

圖3表明，主要感官指標維持在穩(wěn)定狀態(tài)，關鍵指標蛋白質水解度在50 U/g時達到最大值22.3%，還原糖釋放量明顯增加，最大值達到了2.3%，總糖質量分數(shù)仍保持在20%以上，還原糖水解度整體提高到了10%以上，說明纖維素酶對非淀粉多糖分解有一定作用。綜上，選擇50 U/g的纖維素酶做后續(xù)實驗。

2.1.4 木聚糖酶添加量對豆粕品質的影響

非淀粉多糖的化學結構非常復雜，一種酶只能特異降解一種糖苷鍵[20]，因此考慮再加入木聚糖酶形成復合酶共同作用降解豆粕中NSP。圖4表明：主要感官指標維持在穩(wěn)定狀態(tài)，但是蛋白質水解度變化不大，添加復合NSP酶沒有起到強化蛋白質酶解效果。究其原因可能有3點：一是蛋白酶的水解環(huán)境導致NSP酶失活，在添加有蛋白酶的前提下，NSP酶同樣作為蛋白質極有可能作為底物而被降解；二是酶來源不同，其最佳酶活性的溫度和pH值等條件也不同，因而在同一水解條件下應用的效果就不同，且一般NSP酶比較適合酸性環(huán)境，因此，在偏堿性環(huán)境下其酶活就可能受到抑制，達不到酶解的合適條件；三是隨著蛋白酶水平的增加，可作用的底物濃度降低，水解度的差異變小?？偺琴|量分數(shù)明顯下降，最小值為11.7%，降低了近10%，還原糖質量分數(shù)與添加三酶時沒有太大區(qū)別，可能是總糖被分解時還產(chǎn)生了其他非還原糖類物質。

2.2 酶制劑動態(tài)酶解過程的優(yōu)化

2.2.1 酶解時間對豆粕感官的影響

由圖5可以看出，酶解時間對豆粕的顏色、氣味和質地等感官指標均有影響。在36 h之內，時間越長指標變化越明顯，48 h后變化趨勢趨于平緩，說明，在48 h各酶制劑組合酶解豆粕可達到較佳的效果。由圖5還可見，同一時間段內，酶制劑種類的增加并沒有達到感官優(yōu)化的效果。在酶解時間較長后(48～72 h)豆粕為褐色，具有濃郁的香味和粘手的觸感。

2.2.2 酶解時間對豆粕pH值的影響

由圖6可知，在短時間內(12 h)酶解豆粕pH值接近于中性或偏酸性，傾向于原料pH值，這可能是該時間段為初期，酶與物料的接觸不夠充分，酶解效率低導致pH值的變化較小。隨著時間的延長，pH值隨之增大，在后期穩(wěn)定在7.8～8.2。pH值偏中性，說明酶解作用增強且中性蛋白酶的影響最大。

2.2.3 酶解時間對豆粕蛋白質水解度的影響

蛋白質通過水解作用水解為二肽或三肽的產(chǎn)物，具有特殊的生理活性[21-23]，在動物體內要比自由氨基酸和沒有水解的蛋白質更易于吸收[24]，所以蛋白質水解度是衡量蛋白質酶解效率的重要指標。由圖7可知，不同組合的酶制劑在一定的水解時間內，均可以提高豆粕的蛋白質水解度，且隨著反應時間的增加而提高。當達到60 h后，水解度變化趨于平緩。僅添加中性蛋白酶，36 h后蛋白質水解增長幅度減小，72 h測得最大水解度值為22.5%；加入酸性蛋白酶后，水解度在實驗前期得到很大提升，48～72 h后水解程度趨于穩(wěn)定且達到最大值23.8%，優(yōu)于中性蛋白酶單酶水解度，說明兩種酶復合作用可以提高蛋白的水解度；但同時加入NSP酶如纖維素酶或和木聚糖酶后，酶解樣品與中性蛋白酶單獨酶解的對照樣品相比，水解度并沒有得到提高，說明NSP酶并沒有起到強化酶解蛋白質的作用?？紤]到蛋白質的水解效果和時間效益，將酶解時間均定為48 h。

2.2.4 酶解時間對豆粕糖質量分數(shù)的影響

酶制劑酶解時間對豆粕還原糖、總糖質量分數(shù)、還原糖水解度的影響見圖8。由圖8可見，同一時間段還原糖水解度大小并未同外源酶種類的增加而呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。添加中性蛋白酶、酸性蛋白酶所得還原糖水解度較低，但與單酶相比較，其總糖含量提升。添加三酶或四酶時的總糖和還原糖含量均提高。

綜上，考慮酶解時間對豆粕各方面品質的影響，將酶解時間確定為48 h。

3 結論

本文采用單因素試驗設計，研究酶用量及酶解時間對豆粕品質的影響，表明：中性蛋白酶酶解豆粕最佳用量及時間為30 U/g，48 h，該條件下獲得蛋白質水解度為20.1%，還原糖釋放量和總糖質量分數(shù)分別為1.18%，7.44%；雙酶聯(lián)合酶解豆粕優(yōu)化酸性蛋白酶的添加量及酶解時間為50 U/g，48 h，測得豆粕蛋白質水解度、還原糖釋放量和總糖質量分數(shù)分別為22.7%，1.23%，18.01%；三酶復合酶解時優(yōu)化纖維素酶的加酶量及酶解時間為50 U/g，48 h，此時豆粕蛋白質水解度、總糖質量分數(shù)分別為18.3%，18.22%，還原糖釋放量增加，提高了1%；多酶復合酶解木聚糖酶的適宜添加量及反應時間分別是50 U/g，48 h，蛋白質水解度、還原糖釋放量和總糖質量分數(shù)分別為18.3%，1.91%，15.41%。說明，在自然pH值的條件下進行酶解，僅添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶復合酶解的蛋白水解度比較好，同時添加NPS酶對水解度影響不大，但是還原糖釋放量比較高。