吳 磊，許 凱，徐 燕，紀(jì)德華，王文磊，陳昌生，謝潮添

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

維生素是人類和其他生物所必須的微量營養(yǎng)成分之一，在維持生物的新陳代謝平衡中起著至關(guān)重要的作用，是生物多種代謝通路中關(guān)鍵酶的輔因子，維生素缺乏時(shí)會(huì)誘發(fā)一系列疾病的發(fā)生[1]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，B族維生素在藻類的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。許多藻類屬B族維生素的營養(yǎng)缺陷型，其中22%的藻類屬維生素B1(thiamine)的營養(yǎng)缺陷型，5%屬維生素B7(biotin)的營養(yǎng)缺陷型，超過50%的藻類屬維生素B12(cobalamin)的營養(yǎng)缺陷型[2]。由于藻類的維生素B12可能來源于其共生細(xì)菌，因此維生素B12在細(xì)菌與藻類相互作用的研究中越發(fā)受到重視[3]。

維生素B12在自然界中只能由細(xì)菌合成，真核生物不能合成B12，該合成過程需要20多種酶的參與。維生素B12是一種水溶性的咕啉類化合物，又稱鈷胺素，在生物體內(nèi)有多種存在方式，具有重要輔酶功能。目前已知的維生素B12依賴型酶有20多種，如甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-coA mutase，MCM)、谷氨酸變位酶(glutamate mutase,GM)、甲硫氨酸合成酶(methionine synthase H,METH)，其中最為重要的就是甲硫氨酸合成酶[4]。甲硫氨酸是20種必須氨基酸之一，在生物的蛋白合成和甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸能夠顯著提高萊茵衣藻在25 ℃下的耐熱能力。需要指出的是，一些藻類還存在另一種B12非依賴型甲硫氨酸合成酶METE(B12-independent methionine synthase)，在沒有B12條件下也可合成甲硫氨酸。

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)是我國福建省、浙江省和廣東省廣泛栽培的大型經(jīng)濟(jì)海藻，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值[6]。近年來，壇紫菜筏式培養(yǎng)初期的高溫回暖天氣造成 “高溫爛菜”頻繁發(fā)生，給壇紫菜養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。謝波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，某些B12產(chǎn)生菌在與萊茵衣藻共培養(yǎng)時(shí)，能夠顯著提高衣藻的耐熱能力。紫菜等大型海藻中含有較高濃度的維生素B12，與動(dòng)物肝臟中的濃度相當(dāng)[8]。而壇紫菜作為真核藻類，自身并不能合成維生素B12，維生素B12的來源至今仍未確認(rèn)。對(duì)壇紫菜的B12是否來源于其共生原核細(xì)菌還存有疑問，而維生素B12在壇紫菜應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)是否發(fā)揮作用仍不清楚。為了評(píng)估維生素B12在壇紫菜應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)的影響和可能發(fā)揮作用的機(jī)制，本研究考察了高溫下維生素B12對(duì)壇紫菜的生理影響。

1 材料與方法

1.1 藻株來源和高溫處理

實(shí)驗(yàn)選用的壇紫菜品系為Z-61，由集美大學(xué)選育。壇紫菜葉狀體的最適培養(yǎng)溫度為21℃，光照強(qiáng)度50 ～ 60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，每2天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為營養(yǎng)鹽加富的天然海水，營養(yǎng)鹽濃度參考Provasoli’s enrichment solution (PES)[9]。

取長(zhǎng)度為10～15 cm的健康藻體，分別在21 ℃和31 ℃下培養(yǎng)5 d。為了研究維生素B12和甲硫氨酸對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，往培養(yǎng)基中分別添加維生素B12至終質(zhì)量濃度為10 μg/L和100 μg/L，添加甲硫氨酸至終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 藻體長(zhǎng)度和鮮重

分別在高溫處理的第0天及第5天進(jìn)行壇紫菜Z-61葉狀體長(zhǎng)度測(cè)量。用紗布吸干藻體表面水分，測(cè)量藻體鮮重。藻體長(zhǎng)度和鮮重日生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式與數(shù)據(jù)處理方式同參考文獻(xiàn)[10]。

1.3 形態(tài)觀察

為評(píng)估高溫脅迫以及維生素B12和甲硫氨酸的作用，對(duì)壇紫菜Z-61葉狀體進(jìn)行形態(tài)觀察。將葉狀體平鋪在標(biāo)本紙上，對(duì)Z-61葉狀體進(jìn)行拍照。

1.4 最大量子產(chǎn)量

用DIVING-PAM儀(德國，Walz)測(cè)量壇紫菜的光化學(xué)效率及快速光曲線。葉片經(jīng)過15 min暗處理后，用微弱的檢測(cè)光(0.15 μmol/(m2·s))測(cè)量藻體的最小熒光值F0，此時(shí)光系統(tǒng)Ⅱ的所有反應(yīng)中心均處于開放狀態(tài)。然后，給一個(gè)0.8 s的飽和脈沖，獲得最大熒光值Fm，此時(shí)光系統(tǒng)II的所有反應(yīng)中心均處于關(guān)閉狀態(tài)。最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的計(jì)算公式是：(Fm-F0)/Fm。使用8個(gè)不同強(qiáng)度(166，607，1267，1795，2724，3395，4934，6578 μmol/(m2·s))，持續(xù)時(shí)間為10 s的光化光來測(cè)定快速光響應(yīng)曲線。相對(duì)電子傳遞速率(rETR)計(jì)算公式為rETR = yield×0.84×0.5×PAR,其中：yield為光系統(tǒng)Ⅱ的有效光化學(xué)效率，0.84代表大約有84%的入射光被植物/藻體所吸收，0.5代表約50%被吸收的光能分配到光系統(tǒng)Ⅱ，PAR則為光化光的強(qiáng)度。快速光響應(yīng)曲線用公式(Jasby and Platt,1976)ETR=ETRmax×tanh (α×PAR/Pmax)擬合，其中：ETRmax為ETR的最大值，PAR則為光化光的強(qiáng)度，α為光限制部分的初始斜率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差(one-way ANOVA，LSD)分析不同pH處理的差異，P>0.05代表差異不顯著，具統(tǒng)計(jì)意義；P<0.05代表差異顯著，具統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 藻體長(zhǎng)度和鮮重

21℃常溫下，壇紫菜葉狀體長(zhǎng)度日增加速率ΔL達(dá)到(2.77±0.326)cm/d，鮮重平均日增長(zhǎng)速率ΔW達(dá)到(0.045±0.0052)g/d(見表 1)。而31 ℃高溫脅迫下，葉狀體幾乎停止生長(zhǎng)，其長(zhǎng)度和鮮重日增加速率分別約為常溫的7%和9%。維生素B12和甲硫氨酸在高溫脅迫下并未促進(jìn)壇紫菜的生長(zhǎng)。

表 1 壇紫菜葉狀體高溫脅迫下長(zhǎng)度和鮮重平均日增長(zhǎng)速率Tab.1 The length-growth rates and weight-growth rates of P.haitanensis under high temperature stress

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

在高溫處理第5天時(shí)，31 ℃高溫空白對(duì)照組已明顯發(fā)生大面積潰爛(見圖1)，而在外源添加維生素B12和甲硫氨酸下的壇紫菜葉狀體并未出現(xiàn)明顯潰爛，但是在維生素B12100 μg/L處理組和甲硫氨酸1 mmol/L處理組已經(jīng)出現(xiàn)點(diǎn)狀潰爛(見圖1紅色箭頭標(biāo)注處)。說明維生素B12和甲硫氨酸能夠顯著提高壇紫菜葉狀體的耐熱性。

2.3 光合參數(shù)

通過快速光曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)(見圖2)，在高溫脅迫處理下，各組Fv/Fm均呈下降趨勢(shì)；維生素B12處理0～2 d時(shí)與對(duì)照組相比Fv/Fm并未有明顯變化，在處理3 d時(shí)，處理組相較于對(duì)照組Fv/Fm顯著下降，10 μg/L組與100 μg/L組Fv/Fm在整個(gè)高溫脅迫處理過程中都無顯著差異；甲硫氨酸處理組與維生素B12處理組Fv/Fm變化趨勢(shì)整體較為相似，在高溫處理0～2 d時(shí)與對(duì)照組相比Fv/Fm并未有顯著差異，處理3 d時(shí)1 mmol/L組與10 mmol/L 組Fv/Fm均顯著高于對(duì)照組，但處理4 d時(shí)10 mmol/L組Fv/Fm卻顯著低于對(duì)照組，處理5 d時(shí)1 mmol/L 組與10 mmol/L組Fv/Fm卻顯著低于對(duì)照組。提示維生素B12和甲硫氨酸在提高壇紫菜耐高溫能力中都發(fā)揮了重要作用，但作用方式可能存在不同。

通過快速光曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)(見圖3)，在第0天，維生素B12組、甲硫氨酸組和對(duì)照組的曲線幾乎重合，對(duì)rETRmax 、Ik和α的影響較小，變化幅度<30%。而高溫脅迫處理3 d后，維生素B12顯著增強(qiáng)了rETRmax，10 μg/L組上升約60%，100 μg/L組上升約30%。而甲硫氨酸顯著降低了rETRmax 、Ik和α，rETRmax降幅在80左右，Ik和α下降約40%。高溫處理5 d后，所有藻體的rETRmax 、Ik和α都大幅度降低。(見表2)。

表2 快速光曲線的3個(gè)擬合參數(shù)Tab.2 Three parameters fitted from the rapid light curves

3 討論

高溫是壇紫菜養(yǎng)殖過程中最常見的脅迫之一，高溫脅迫會(huì)對(duì)壇紫菜的各項(xiàng)生理指標(biāo)造成影響。在持續(xù)的高溫脅迫下，壇紫菜基本停止生長(zhǎng),長(zhǎng)度日平均生長(zhǎng)速率在0.1～0.2 cm/d左右，部分潰爛藻體鮮重甚至呈負(fù)增長(zhǎng)(見表 1)。李兵等[11]研究表明，壇紫菜在高溫30 ℃靜水脅迫下的品質(zhì)會(huì)顯著降低，生長(zhǎng)緩慢，光合色素含量、粗蛋白含量、總氨基酸含量會(huì)顯著降低。壇紫菜在高溫脅迫下生長(zhǎng)受到抑制，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，藻體會(huì)發(fā)生潰爛。但是在外源添加維生素B12和甲硫氨酸后，藻體并未發(fā)生明顯潰爛(見圖1)，說明維生素B12和甲硫氨酸能夠提高壇紫菜的耐熱性。謝波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下萊茵衣藻METE基因的表達(dá)量會(huì)顯著下調(diào)，METH基因部分表達(dá)；在添加維生素B12后，只有METH基因能夠發(fā)揮作用繼續(xù)合成甲硫氨酸，從而提高衣藻的耐熱能力。

光合作用是植物最重要的生理反應(yīng)之一，也是對(duì)高溫響應(yīng)最為敏感的生理反應(yīng)。高溫會(huì)對(duì)壇紫菜光反應(yīng)中心造成影響，導(dǎo)致光合色素的含量下降。光合參數(shù)能夠直接反應(yīng)植物的光合作用。壇紫菜葉狀體在高溫脅迫下各項(xiàng)光合參數(shù)都受到影響(見圖 2)。所有藻體Fv/Fm在高溫處理前2 d時(shí)未見明顯下降，2 d后開始下降(見圖 2)。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜Z-61在29 ℃高溫下培養(yǎng)2 d未見顯著下降，這與本研究結(jié)果保持一致。本研究在添加了維生素B12和甲硫氨酸處理2 d后，rETRmax 、Ik和α下降速率會(huì)減慢(見圖3)，這提示添加了維生素B12和甲硫氨酸的藻體光合保護(hù)能力更強(qiáng)；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)(3～5 d)，維生素B12能夠繼續(xù)保護(hù)壇紫菜的光合系統(tǒng)，維生素B12處理組的ETR和Fv/Fm的一致性很高，但是添加了甲硫氨酸的藻體在脅迫后期光合參數(shù)下降較快，高濃度甲硫氨酸處理組降低了ETR和Fv/Fm，而低濃度組僅降低了Fv/Fm，且對(duì)ETRmax沒有顯著影響。

外源添加維生素B12，一方面可以促進(jìn)壇紫菜合成甲硫氨酸。甲硫氨酸可參與有關(guān)抗逆蛋白的合成或者作為甲基供體參與甲基化來協(xié)助壇紫菜應(yīng)對(duì)脅迫。Giovanelli等[13]研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的甲硫氨酸有兩種去向，大約20%的甲硫氨酸將用于合成蛋白質(zhì)參與各種生理活動(dòng)，剩下80%的甲硫氨酸用于合成生物體內(nèi)主要的甲基供體S-腺苷甲硫氨酸，用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的甲基化反應(yīng)。甲基化在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用。另一方面，維生素B12也可以調(diào)節(jié)某些相關(guān)基因的表達(dá)來共同應(yīng)對(duì)脅迫。在只添加甲硫氨酸的條件下，通過相關(guān)蛋白的合成和甲基化調(diào)控可以維持壇紫菜的存活，但是對(duì)壇紫菜PSⅡ反應(yīng)中心的保護(hù)不及外源添加維生素B12，維生素B12可能激活了某些抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，保證了光系統(tǒng)的正常運(yùn)行。在原核生物中，維生素B12可以通過控制核糖開關(guān)(Riboswitch)對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]，但是，藻類中目前仍未發(fā)現(xiàn)與維生素B12相關(guān)的核糖開關(guān)。綜上所述，維生素B12和甲硫氨酸在壇紫菜應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)發(fā)揮了重要作用，但作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。