陳朝會(huì)，張正濤，蘇魯方

（江漢大學(xué) 交叉學(xué)科研究院，湖北 武漢 430056）

0 引言

21世紀(jì)，隨著人們生活水平的進(jìn)一步提高，對(duì)疾病的早期診斷提出了更高的要求，而核酸、蛋白質(zhì)和微量元素的變化在一定程度上可以反映某些疾病的早期病變，例如：癌胚抗原超過20 μg∕L時(shí)往往提示有消化道腫瘤，70%～95%的原發(fā)性肝癌患者血清中AFP高達(dá)250 μg∕mL～6 mg∕mL，因此，分子生物水平上的早期診斷成為疾病檢測(cè)的趨勢(shì)。分子生物水平上的診斷包括核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)。核酸是生物體內(nèi)重要的遺傳信息載體，在生命活動(dòng)中起著存儲(chǔ)和傳遞遺傳信息的作用，決定著生物體的生長(zhǎng)、遺傳和變異等一系列重大的生命現(xiàn)象。核酸突變或缺失等都將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥是珠蛋白β基因的點(diǎn)突變引起的；白化病是酪氨酸酶基因缺失引起的黑色素缺乏或合成障礙所導(dǎo)致的。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，許多重要的生命現(xiàn)象和生理活動(dòng)都是通過蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)含量的變化與疾病息息相關(guān)，因此許多疾病相關(guān)蛋白的檢測(cè)在病理學(xué)、基因組學(xué)等方面有重要的參考價(jià)值。如葉酸受體是一種與腫瘤相關(guān)的跨膜單鏈糖蛋白，該蛋白在人體的很多腫瘤細(xì)胞，如卵巢癌、脈絡(luò)叢癌、室管膜癌等中過度表達(dá)，但是在正常細(xì)胞中卻很少表達(dá)，甚至不表達(dá)。葉酸受體的檢測(cè)可以為疾病診斷提供許多有價(jià)值的信息。

目前常用檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)的方法有循環(huán)伏安法、電致化學(xué)發(fā)光法、紫外-可見分光光度法（比色法）、質(zhì)譜法、熒光分光光度法等。電分析法簡(jiǎn)單快速，但是電極修飾過程繁瑣，并且需要一定的電化學(xué)基礎(chǔ)；化學(xué)發(fā)光法線性范圍寬，反應(yīng)快且不需要光源，但是應(yīng)用對(duì)象受限、不容易建立均相體系；比色法儀器簡(jiǎn)單、直觀性強(qiáng)，但是其靈敏度有待進(jìn)一步提高；質(zhì)譜法則需要借助昂貴的儀器。熒光分光光度法因其靈敏度高，適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞等的檢測(cè)。同時(shí)，納米科技的快速發(fā)展，為熒光分析法提供了更廣闊的發(fā)展空間。本文主要介紹新型納米熒光材料在核酸及蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 量子點(diǎn)在核酸及蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1 傳統(tǒng)量子點(diǎn)

量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是一種三維受限的準(zhǔn)零維納米材料，其直徑范圍為1～100 nm，當(dāng)其尺寸小于或等于其玻爾半徑時(shí)，在外界激發(fā)下可以發(fā)射熒光。量子點(diǎn)一般由II-VI族元素（如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等）［1］、III-V族元素（如InP、InAs等）或IV-VI族元素（如PbS、PbSe）［2］的半導(dǎo)體材料構(gòu)成，也可由兩種或兩種以上的半導(dǎo)體材料構(gòu)成核∕殼結(jié)構(gòu)（如CdSe∕ZnS核∕殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)等），廣義上的量子點(diǎn)還包括硅點(diǎn)和碳點(diǎn)。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有量子產(chǎn)率高、Stockes位移大、抗光漂、一元激發(fā)、多元發(fā)射等優(yōu)點(diǎn)，這使其在核酸和蛋白檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景［3-4］。

ZHANG等［5］合成硫代磷酸功能化的DNA量子點(diǎn)，利用合成序列中的識(shí)別部分與特定的乙肝病毒序列形成雙鏈前后的熒光強(qiáng)度變化，構(gòu)建了基于DNA功能化量子點(diǎn)的核酸傳感器。ENKIN等［6］利用BHQ與DNA功能化納米銀簇之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（fluorescence resonance energy transfer,FRET），結(jié)合鏈置換反應(yīng)，構(gòu)建了多個(gè)目標(biāo)序列的同時(shí)檢測(cè)平臺(tái)。為拓展量子點(diǎn)的應(yīng)用，CHEN等［7］基于N-乙酰半胱氨酸包裹的CdTe量子點(diǎn)和釕的配合物之間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，建立雙色檢測(cè)蛋白質(zhì)的分析方法。ZHANG等［8］利用一步法合成的DNA功能化無鎘量子點(diǎn)與二硫化鎢之間的共振能量轉(zhuǎn)移作用，結(jié)合小分子末端保護(hù)技術(shù)，建立了高靈敏、高選擇性的蛋白質(zhì)檢測(cè)法。MA等［9］利用不同蛋白質(zhì)對(duì)雙色巰基乙酸（TGA）封端的CdTe量子點(diǎn)的光誘導(dǎo)自組裝及量子點(diǎn)的熒光信號(hào)（顏色和強(qiáng)度）的影響，建立雙通道熒光傳感器以同時(shí)區(qū)分多種蛋白質(zhì)。

在過去20年中，量子點(diǎn)可調(diào)諧的熒光性質(zhì)讓其成為熒光傳感研究中的明星材料。但是隨著研究的繼續(xù)深入，其潛在毒性也不可避免地暴露出來，因此需要尋求新型無毒納米材料。

1.2 硅點(diǎn)

熒光硅量子點(diǎn)（silica nanoparticles,SiNPs）作為一種典型的間接帶隙半導(dǎo)體納米材料，具有獨(dú)特的發(fā)光性能，當(dāng)其半徑小于或接近激子波爾半徑（硅的波爾半徑小于5 nm）時(shí)會(huì)產(chǎn)生量子限域效應(yīng)。硅量子點(diǎn)的量子限域效應(yīng)增加了其直接帶隙躍遷的輻射復(fù)合，進(jìn)而增加發(fā)光效率且使發(fā)光峰位置移向高能區(qū)，表現(xiàn)出其發(fā)光波長(zhǎng)受核尺寸控制的特性，而且隨著量子點(diǎn)尺寸的減小，其發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移。此外，與傳統(tǒng)含重金屬Cd量子點(diǎn)相比，硅量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)性能、良好的生物相容性及無毒的特性，這些優(yōu)勢(shì)使得其在生物醫(yī)學(xué)方面呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［10-12］。

SU等［13］利用硅量子點(diǎn)作載體，將硫醇功能化且修飾有熒光染料的DNA與帶有烯烴鏈端的硅量子點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián)，制備了DNA功能化的硅量子點(diǎn)，加入目標(biāo)MicroRNA-21后，MicroRNA-21與偶聯(lián)的DNA可形成更穩(wěn)定的DNA∕RNA復(fù)合物，使猝滅劑鏈被置換出來，體系熒光回升。通過監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的定量檢測(cè)（圖1）。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程中，硅量子點(diǎn)常被用作供體，如KIM等［12］利用量子點(diǎn)作供體，金納米棒作受體，結(jié)合抗原抗體特異性作用，建立結(jié)核分枝桿菌Ag85B抗原的高選擇性測(cè)定法；CHENG等［14］基于硅量子點(diǎn)與有機(jī)染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，利用蛋白酶切割肽鏈阻斷共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生構(gòu)建了蛋白酶?jìng)鞲衅鳌?/p>

圖1 硅點(diǎn)合成及檢測(cè)MicroRNA-21示意圖Fig.1 Two-step synthesis of SiNP ODN conjugates and derection of MicroRNA-21

1.3 碳點(diǎn)

碳點(diǎn)（Carbon nanodots,C-dots）是由分散的類球狀碳顆粒組成，是一種新型的碳基零維納米材料。碳點(diǎn)具有水溶性好、低毒、原料來源廣、成本低、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此它的出現(xiàn)引起了研究者廣泛的關(guān)注，常被用來構(gòu)建核酸和蛋白質(zhì)的生物傳感器［15-17］。LOO等［18］基于單雙鏈DNA與羧基化碳點(diǎn)之間作用力不同及羧基化碳點(diǎn)對(duì)染料的猝滅，建立了均相檢測(cè)核酸的方法。XU等［19］以適配體功能化的碳點(diǎn)為熒光信號(hào)，利用目標(biāo)蛋白質(zhì)與適配體特異性作用，構(gòu)建了檢測(cè)凝血酶的傳感器。該方法需要通過離心除去沒結(jié)合目標(biāo)蛋白的DNA，使檢測(cè)步驟復(fù)雜化。為此，ZHANG等［20］基于Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)與碳點(diǎn)之間的磷光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，建立了簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)凝血酶的方法（圖2）。基本原理如下：設(shè)計(jì)適配子修飾的量子點(diǎn)，沒有目標(biāo)蛋白存在時(shí)，碳點(diǎn)與適配子之間的π-π相互作用使之靠近Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)并發(fā)生磷光能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)體系沒有熒光；加入目標(biāo)蛋白后，蛋白與適配子結(jié)合，π-π堆積相互作用的消失，碳點(diǎn)遠(yuǎn)離ZnS量子點(diǎn)，磷光能量轉(zhuǎn)移過程被抑制，ZnS量子點(diǎn)的磷光恢復(fù)。

圖2 基于Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)與碳點(diǎn)之間的磷光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)檢測(cè)凝血酶示意圖Fig.2 Thrombin detection based on phosphorescence energy transfer effect between Mn doping ZnS quantum dot and carbon dot

半導(dǎo)體量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率高、生物相容性好，但是其表面改性及功能化操作復(fù)雜，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。

2 金屬納米簇在核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 金簇

金屬納米簇是由幾個(gè)至幾百個(gè)金屬原子組成的新型熒光納米材料，其直徑一般小于3 nm。與半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)染料相比，金屬納米簇具有尺寸小、無毒、良好的生物相容性以及在鹽溶液中穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)［21］。常見的金屬納米簇有金簇、銀簇、銅簇等［22-23］。其中，金納米簇（Au nanoclusters，AuNCs）由于合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用［24-25］。

XIE等［21］以牛血清白蛋白為穩(wěn)定劑和還原劑，利用堿性條件下牛血清白蛋白上的酪氨酸殘基還原氯金酸，制備牛血清白蛋白包裹的熒光金簇。在此基礎(chǔ)上，LI等［26］利用變性牛血清白蛋白（denatured bovine serum albumin,dBSA）合成的水溶性金簇為熒光信號(hào)，基于S-乙酰硫代膽堿碘化物水解產(chǎn)物硫代膽堿對(duì)dBSA-AuNCs的猝滅作用，建立了無需染料標(biāo)記的乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)方法（圖3）。該方法原理如下：在乙酰膽堿酯酶存在的條件下，其底物S-乙酰硫代膽堿碘化物水解產(chǎn)生硫代膽堿，硫代膽堿分子中硫醇基與dBSA-AuNCs結(jié)合，使金簇的熒光發(fā)生猝滅；沒有目標(biāo)物存在時(shí)，S-乙酰硫代膽堿碘化物水解反應(yīng)不能發(fā)生，dBSA-AuNCs熒光強(qiáng)度不變。但是由于難于在金簇上修飾核酸和蛋白質(zhì)，這使得金簇的應(yīng)用大大受限。

圖3 變性牛血清白蛋白指導(dǎo)的熒光金簇的合成及乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)示意圖Fig.3 Schematic of dBSA-directed synthesis of fluorescent Au clusters and detection of AChE activity

2.2 銀簇

DNA功能化的銀納米簇因其易于合成及功能化、較小的粒徑和毒性［27-30］、好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)受到了研究者的青睞。2004年，DICKSON等［27］首次發(fā)現(xiàn)富含胞嘧啶的DNA序列可用于納米熒光銀簇的合成，該發(fā)現(xiàn)建立了納米團(tuán)簇和DNA分子之間的連接，為后期DNA功能化銀簇的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)比不同序列合成的銀團(tuán)簇的發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了堿基序列對(duì)銀團(tuán)簇的發(fā)射波長(zhǎng)調(diào)控［31］。基于銀簇的熒光性質(zhì)及依賴序列合成的特點(diǎn)，研究者們構(gòu)建了一系列檢測(cè)蛋白質(zhì)［32-35］、細(xì)胞［36-38］等的傳感器。2013年，WANG等［39］首次發(fā)現(xiàn)，DNA功能化納米銀簇和嵌入Hemin的G四聯(lián)體之間存在光致電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)。該效應(yīng)的強(qiáng)弱與銀簇和G四鏈體結(jié)構(gòu)間距離有關(guān)，當(dāng)距離超過15個(gè)堿基時(shí)，熒光猝滅效率只有50%。基于這一發(fā)現(xiàn)，并通過將適配子序列引入到探針中，構(gòu)建了檢測(cè)蛋白質(zhì)的傳感器。但是由于G四鏈體的猝滅效率不高，使得該方法具有高的背景信號(hào)。為了解決這一問題，LIU等［40］利用石墨烯做猝滅劑，構(gòu)建了檢測(cè)目標(biāo)核酸和蛋白質(zhì)的傳感器（圖4）。沒有目標(biāo)核酸∕蛋白質(zhì)存在時(shí)，DNA功能化的納米銀簇吸附在石墨烯表面，銀簇?zé)晒獗皇┾?；加入目?biāo)核酸∕蛋白后，目標(biāo)核酸∕蛋白與探針DNA結(jié)合，形成雙鏈DNA或使DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并脫離石墨烯表面，納米銀簇的熒光得到恢復(fù)。

圖4 基于DNA功能化銀簇/氧化石墨烯檢測(cè)目標(biāo)核酸和蛋白Fig.4 Detection of target DNA and thrombin with DNA-templated AgNCs/GO hybrids as sensing matrices

銀簇合成原料廉價(jià)、易得且其表面易于修飾核酸，這使得銀簇在核酸及蛋白檢測(cè)中應(yīng)用廣泛［41-42］，但是，銀簇的合成需要依賴特定序列的DNA模板，相對(duì)耗時(shí)且成本較高。為了系統(tǒng)地研究不同序列與所合成的納米顆粒之間的相互關(guān)系，需要建立一種易于操控的DNA模板納米顆粒合成方法。

2.3 銅簇

DNA功能化的銅納米簇（Copper nanoclusters,CuNCs）是近年來新報(bào)道的一類熒光納米顆粒。2010年ROTARU等［43］發(fā)現(xiàn)，銅離子在抗壞血酸存在的條件下可以被還原成銅納米顆粒，這些銅納米顆粒聚集在雙鏈DNA的大溝中形成穩(wěn)定的銅納米簇；并且隨著雙鏈DNA序列增長(zhǎng)，合成的銅納米簇粒徑變大、熒光增強(qiáng)。SONG等［44］進(jìn)一步研究了雙鏈DNA堿基對(duì)組成對(duì)銅納米簇形成的影響，發(fā)現(xiàn)含有A-T堿基對(duì)的雙鏈更易于形成熒光銅簇，而G-C堿基對(duì)則不會(huì)形成。通過透射電鏡、熒光壽命等表征手段證明，銅納米顆粒的粒徑和熒光壽命可以通過雙鏈DNA的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)控。QING等［45］通過考察不同堿基對(duì)銅納米顆粒合成的影響，發(fā)現(xiàn)銅納米簇能夠選擇性地在單鏈多聚T堿基序列中形成，并以該聚T堿基模板化的熒光CuNPs作為熒光探針，建立了新型的無需標(biāo)記檢測(cè)S1核酸酶的方法。作為非標(biāo)記探針，DNA功能化銅簇用于生化檢測(cè)的靈敏度有待進(jìn)一步提高，為此，研究者們將信號(hào)放大技術(shù)與DNA功能化銅簇結(jié)合，建立了多種高靈敏檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)的方法［46］。YE等［47］通過TdT的酶促聚合反應(yīng)得到聚T堿基的DNA序列，利用銅離子和T堿基之間的相互作用，原位合成了紅色熒光的銅納米顆粒，并以此為熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)了多聚核酸激酶的定量檢測(cè)。

3 結(jié)語

與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比，新型熒光納米材料易于合成，原料廉價(jià)易得且自身具有熒光，這些優(yōu)勢(shì)使得其在核酸和蛋白檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用。然而，現(xiàn)有新型熒光納米材料仍存在一些需要改進(jìn)的地方，如穩(wěn)定性、毒性、靈敏度等。對(duì)這些性質(zhì)以及表面改性路線的研究會(huì)進(jìn)一步拓寬這些材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，為生物傳感、生物成像、藥物輸送和高級(jí)治療等提供重要的參考。