李 燦，唐利軍，茹 琴，周 梅，李超英*

（1.江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430073）

戒毒一號是江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院臨床效驗方，由延胡索、黨參、西洋參、甘草、茯苓、白術(shù)、黃芪、當歸8味中藥組成，各單味藥對應(yīng)的劑量分別為10 g、15 g、3 g、10 g……。其中延胡索是君藥，具有活血、行氣、息風止痛的功效；白術(shù)、茯苓、西洋參、甘草、黨參五藥配伍，輔助君藥，具有活血行氣，溫經(jīng)止痛的功效，共為臣藥；當歸、黃芪二藥配伍，具有氣血雙補的功效，共為佐使藥。諸藥配伍，主要用于對甲基苯丙胺類新型毒品成癮患者的脫毒治療，具有良好的鎮(zhèn)靜、安神作用。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜廣泛運用于中藥材和中成藥質(zhì)量控制的研究［1-3］。為了更好地保證戒毒一號臨床療效穩(wěn)定、安全可控，本研究通過分析戒毒一號中各代表成分的含量及對應(yīng)的藥理作用，選定戒毒一號中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1作為考察指標，應(yīng)用高效液相色譜法對10批次戒毒一號樣品進行分析比較，尋找上述指標之間的關(guān)系，建立中藥復(fù)方戒毒一號的指紋圖譜，為戒毒一號的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ulti Mate 3000高效液相色譜儀（Ulti-mate-3000 RS四元泵、TCC-3000 SD柱溫箱、DAD-3000檢測器，20 μL定量環(huán)的手動進樣、Chorme Leon 7.0色譜工作站），TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），真空干燥機（上海豫明儀器有限公司），KQ200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SZ-97自動三重純水蒸餾儀（上海亞榮生化儀器廠），JYH-B40Q1中藥煎煮機（廣東小熊電器有限公司），BSA223S千分之一分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），SK-20 pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑

甲醇（批號 M158-4）、乙腈（批號 M157-4）、三乙胺（批號 M182）、乙酸（批號 M041978）三乙胺（批號M38810）均為色譜純，均購于北京邁瑞達科技有限公司，水為超純水（由SZ-97自動三重純水蒸餾儀制得），其他試劑均為分析純。戒毒一號10批樣品（武漢生物醫(yī)學(xué)研究院提供，批號分別為1704102、1704103、1704104、1704222、1704223、1704224、1705066、1705067、1705068、1705069（批號命名方式為：XX-XX-XX-X，年-月-日-批次）。

1.3 對照品

延胡索甲素（Corydaline，批號 518-69-4）、延胡索乙素（dl-Trtrahydropalmatine，THP，批號#6024-856）、小檗堿（Brerberine，批號 2086-83-1）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，批號 1405-86-3）、人參皂苷Re（Ginsenoside Re，批號 #52286-59-6）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，批號 #41753-43-9）標準品均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。

2 方法

2.1 延胡索乙素、延胡索甲素、小檗堿、甘草酸色譜條件的選擇

色譜柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-磷酸緩沖鹽（0.005 mol∕L的磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol∕L的磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，再以0.1%醋酸水溶液（三乙胺溶液調(diào)節(jié)pH為6.4），采用梯度洗脫（0～20 min 5%～20%乙腈和95%～80%0.2%磷酸，20～40 min 20%～30%乙腈和80%～70%0.2%磷酸，40～55 min 30%～60%乙腈和70%～40%0.2%磷酸，55～60 min 60%～80%乙腈和40%～20%0.2%磷酸，60～65 min 5%乙腈和95%0.2%磷酸）柱溫：30℃；體積流量：1 mL∕min；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL，記錄65 min內(nèi)的圖譜。

2.2 人參皂苷Re、人參皂苷Rg1色譜條件的選擇

色譜柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈-純水，二元梯度洗脫（0～20 min 18%～22%乙腈和82%～78%純水，20～30 min 22%～32%乙腈和78%～68%純水，30～45 min 32%～34%乙腈和68%～66%純水，45～50 min 80%乙腈和20%純水，50～55 min 18%乙腈和82%純水）色譜柱柱溫：30 ℃；流動相：體積流量：1 mL∕min；檢測波長：203 nm；進樣量：20 μL，記錄55 min內(nèi)的圖譜。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取戒毒一號中延胡索、黨參、西洋參等8味中藥，總重量為94 g，置于1 400 mL純水浸泡30 min后，用中藥煎煮機大火加熱1 h，再文火煮沸3 h后分離煎出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將煎出液濃縮至400 mL即得所需濃度藥液。取10 mL藥液并進行真空冷凍干燥處理。將干燥后的樣品，加10 mL 80%甲醇溶解，并在50 kHz，120 W條件下超聲40 min后離心，取上層清液過0.45 μm微孔濾膜濾過。重復(fù)上述操作10次，即得10個不同批次的供試品。

2.4 標準品溶液的制備

電子分析天平分別精密稱取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1標準品0.5、10、10、50、10、10 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度，搖勻后放置，即得濃度為0.05 mg∕mL延胡索甲素、1 mg∕mL延胡索乙素、1 mg∕mL小檗堿、5 mg∕mL甘草酸、1 mg∕mL人參皂苷Re、1 mg∕mL人參皂苷Rb1標準品儲備液。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)驗證

3.1.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3項下各標準品溶液各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，配制成含有不同濃度延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1混合標準品溶液，吸取20 μL分別進樣3次，按照2.1項下的色譜條件，以封面積值（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得各指標線性回歸方程分別為：延胡索甲素Y=0.352 6X+0.849（R2=0.998 5），延胡索乙素Y=0.157X+0.935 3（R2=0.998），小檗堿Y=0.488 2X+3.488 9（R2=0.999 7），甘草酸Y=0.010 2X+0.175 2（R2=0.998 1），人參皂苷ReY=0.179 5X+0.096 7（R2=0.998 2），人參皂苷Rb1Y=0.083 1X+0.451 6（R2=0.998 2）。結(jié)果表明，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1均在1～167 μg∕mL濃度線性范圍內(nèi)峰面積積分值呈較好線性關(guān)系。

3.1.2 精密度試驗 取2.3項下的供試品溶液，按2.1、2.2項下色譜條件連續(xù)測定6次，結(jié)果顯示共有峰的相對保留時間RSD均小于0.51%，共有峰的相對峰面積RSD均小于1.06%，說明儀器的精密度良好。

3.1.3 專屬性試驗 用手動進樣環(huán)精密吸取10 μL甲醇溶劑，注入高效液相色譜儀，記錄180 min內(nèi)的色譜峰。結(jié)果顯示，甲醇對戒毒一號的指紋圖譜中共有峰檢出無影響，專屬性較好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 取2.3項下同一批次的供試品溶液注入高效液相色譜儀，并在第一次進樣后的3、6、9、12、24 h各進樣1次，按2.1、2.2項下色譜條件測定，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，12次檢測的圖譜結(jié)果顯示共有峰的相對峰面積RSD均小于1.03%，共有峰的相對保留時間RSD均小于0.45%。

3.1.5 重現(xiàn)性試驗 取2.3項下同一批次供試品溶液平均分成6等份，按2.1、2.2項下色譜條件進行測定，檢測結(jié)果顯示共有峰的相對峰面積RSD均小于1.01%，且共有峰的相對保留時間RSD均小于0.54%，說明本方法的重現(xiàn)性好。

3.2 戒毒一號HPLC指紋圖譜的確立

按照2.1、2.2項下色譜條件對10批戒毒一號供試品進行測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件處理各供試品所得的指紋圖譜，生成戒毒一號HPLC指紋圖譜共有模式。并標定了19個穩(wěn)定性和重復(fù)性好、吸收強、特征明顯的色譜峰為共有峰，10批戒毒一號供試品和對照品的色譜疊加圖普見圖1。從指紋圖譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，S7號峰高度適度、峰型對稱、分離度較好，因此選擇S7號峰作為參照峰。10批樣品平均相似度為0.979，各共有特征峰相對面積占總峰面積的74.43%，說明10批戒毒一號的HPLC指紋圖譜相似度良好。

圖1 10批不同戒毒一號樣品的指紋圖譜Fig.1 High performance liquid chromatographic fingerprints of 10 batches of JDYH samples

3.3 戒毒一號指紋圖譜中特征峰的歸屬分析

取戒毒一號中單味藥材，按戒毒復(fù)方的煎煮及供試品制備方法制備藥材溶液；同時取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、Rb1對照品用甲醇稀釋成適當質(zhì)量濃度；按照2.1、2.2項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖2。通過比較各色譜峰保留時間并對比圖1確定各峰的來源。其中19個共有峰在對應(yīng)的藥材具有明顯的歸屬感，其中9～17號峰與延胡索藥材有明顯的歸屬性，1～5號峰為黨參藥材的歸屬峰，4～8、18號峰是甘草藥材的歸屬峰。其中11、13、15號峰是延胡索藥材中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿，18號峰是甘草中的有效成分甘草酸。

圖2 戒毒一號指紋圖譜特征峰歸屬Fig.2 Characteristic peaks of fingerprints of JDYH

3.4 戒毒一號中各檢測指標的含量測定

經(jīng)測定中藥戒毒復(fù)方，每毫升中藥復(fù)方水煎劑中，延胡索甲素含量為28.33 μg，延胡索乙素的含量為27.66 μg，小檗堿含量為 3.18 μg，甘草酸含量為381.98 μg，人參皂苷Re為 279.06 μg，人參皂苷Rb1為196.47 μg。圖3為中藥戒毒復(fù)方樣品中，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸的含量測定圖譜。圖4為中藥戒毒復(fù)方樣品中，人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量測定圖譜。

圖3 戒毒一號中延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸指紋圖譜Fig.3 High performance liquid chromatographic fingerprints of corydaline，tetrahydropalmatine，berberine and glycyrrhizic acid

圖4 戒毒一號中人參皂苷Re、人參皂苷Rb1指紋圖譜Fig.4 High performance liquid chromatographic fingerprints of ginsenoside Re and ginsenoside Rb1

4 結(jié)論與討論

指紋圖譜的大信息量克服了中藥復(fù)方成分復(fù)雜難以確定的難題，是國際公認控制中藥材質(zhì)量的常用手段［4］。戒毒一號是多組分制劑，療效也是多靶點作用的綜合結(jié)果，所以測定的指標性成分越多，對于控制中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量越有利。已知戒毒一號中含有延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等有效成分，采用HPLC法測定并查閱相關(guān)文獻報道，將上述成分作為指標性成分，既可以增加質(zhì)量控制的覆蓋面，又可克服藥材中所含若干種成分多少無固定比例規(guī)律的缺陷［5-11］。從10批戒毒一號樣品的高效液相指紋圖譜可以看出，不同批次的戒毒一號各色譜峰的相對保留時間基本一致，所含成分基本相同，具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、專屬性。符合指紋圖譜的要求，為戒毒一號的質(zhì)量控制提供良好的依據(jù)。

延胡索作為戒毒一號中君藥，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果顯著，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，單味藥延胡索的有效成分延胡索乙素不僅能降低海洛因的強化行為，還能有效抑制甲基苯丙胺和嗎啡依賴大鼠條件線索誘導(dǎo)的復(fù)吸行為［12-14］。檢測結(jié)果顯示其有效成分延胡索甲素含量為28.33 μg∕mL、延胡索乙素含量為27.66 μg∕mL，小檗堿含量為3.18 μg∕mL，測定實驗結(jié)果專屬性良好、無陰性干擾，可以作為中藥戒毒復(fù)方質(zhì)量控制的指標性成分。甘草、黨參作為戒毒一號中占比較大的佐藥，檢測結(jié)果顯示甘草的主要成分甘草酸含量為381.98 μg∕mL，黨參的主要成分人參皂苷Re含量為279.06 μg∕mL，人參皂苷Rb1含量為196.47 μg∕mL，測定結(jié)果專屬性良好、無陰性干擾、含量較高，可以作為戒毒一號質(zhì)量控制的指標性成分。因此用延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量來控制戒毒一號的質(zhì)量科學(xué)、可行、有效。