舒婷婷，黃文文，楊智慧，喻艷華

（江漢大學 交叉學科研究院，湖北 武漢 430056）

熒光探針作為一種檢測工具，主要原理是以熒光光譜為手段，受體與待檢測物之間特異結合后（絡合或者反應）從而改變熒光基團的結構，導致其熒光光譜發(fā)生改變，通過這種前后變化實現對待檢測物種的定性或定量分析。這種分析方法由于其靈敏度高、選擇性好、操作簡單，在環(huán)境檢測、化學、食品分析、醫(yī)藥等各個方面已經得到廣泛應用。用于熒光探針的熒光染料種類繁多，有羅丹明類［1-2］、熒光素類［3-5］、香豆素類［6-7］、萘類［8-9］等，這些熒光染料有的存在熒光量子產率低、光穩(wěn)定性不好、易光漂白等不足。相對而言，BODIPY類［10-11］熒光染料由于具有非常穩(wěn)定的光譜性質、較高的熒光量子產率、高摩爾吸光系數、良好的光穩(wěn)定性、較窄的熒光光譜峰寬、對pH不敏感等優(yōu)點［10-17］被廣泛應用于各類熒光探針。對BODIPY的結構進行修飾，得到的BODIPY衍生物可以作為熒光探針對陽離子、陰離子、小分子、生物分子等進行檢測，并可應用于環(huán)境檢測、食品分析、生命科學、醫(yī)藥診斷等領域［18-23］。

1 BODIPY類染料的基本結構和性質

TIERBS和KREUZER［24］在1968年首次報道BODIPY類熒光染料，其結構式如圖1所示。

圖1 BODIPY中心骨架結構Fig.1 Structure of BODIPY core

BODIPY基本上是由2分子吡咯與1分子醛類化合物在酸催化下，或者1分子吡咯與1分子酸酐或酰氯化合物縮合后，再與三氟化硼乙醚溶液絡合后得到其衍生物［25］。KAROLIN等［26］在1994年報道BODIPY中心骨架結構的性質，其摩爾消光系數在90 000 mol·L-1·cm左右，最大吸收峰在500 nm左右，熒光量子產率大于80%，并且其熒光壽命不受其他極性溶劑的影響，具有穩(wěn)定的化學性質。但是其衍生物依舊有一些不足，包括水溶性差，發(fā)射波長大多都小于600 nm，因此為了擴大應用范圍，需要對其進行官能團修飾。目前，通過在改善和修飾BODIPY的結構已經開發(fā)出各類基于BODIPY的熒光探針。

2 BODIPY類熒光探針對陽離子的檢測

2.1 對Zn2+的檢測

鋅離子是人體內排在鐵離子之后第二豐富的過渡金屬離子。Zn2+在人體發(fā)育、免疫、內分泌等生理過程中起著極其重要的作用，對神經信號傳遞、基因表達起調節(jié)作用。缺鋅易引起免疫功能下降、侏儒癥、生殖系統(tǒng)功能受損、缺血癥、毒血癥、肝硬化等。因此，發(fā)展特異性識別Zn2+的探針十分重要。

2018年，XIA等［27］報道了一種對Zn2+有高選擇性識別的比率型熒光探針1a（圖2）。在V（CH3CN）∶V（0.02 mol∕L HEPES buffer）=1∶1的溶液中探針1a通過與Zn2+1∶1絡合，使其最大吸收峰從525 nm紅移至552 nm，溶液由淺黃色變?yōu)樽仙?，同時熒光發(fā)射光譜的最大吸收峰從540 nm紅移至580 nm。此探針能特異性識別Zn2+，且最低檢測限可達87 nmol∕L。此外，探針1a可應用到檢測活細胞的胞內Zn2+。

圖2 Zn2+探針1aFig.2 Zn2+probe 1a

2.2 對Hg2+的檢測

Hg2+是一種毒性極強的金屬離子，可通過食物鏈積聚在大腦和腎臟，對中樞神經系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)造成嚴重損害，會導致一些人類疾病，如肢體疼痛癥疾病、水俁病以及Hunter-RusseⅡ綜合征。2018年，MAITY等［28］設計合成了基于BODIPY的“off-on”型Hg2+熒光探針2 a（圖3），可高選擇性、高靈敏度地檢測溶液中的Hg2+。該探針BODIPY 8位置上取代基上的氮和氧原子帶有孤對電子，在激發(fā)光照射下，發(fā)生光誘導的電轉移（photoinduced electron transfer，PET），導致BODIPY的熒光發(fā)生淬滅。當加入Hg2+時，其與氮和氧的上的孤對電子發(fā)生配位，從而阻斷PET過程，導致熒光顯著增強，熒光量子產率由0.048升至0.41，探針熒光強度與Hg2+濃度在0～2.5 nmol∕L范圍內成正比，檢測限達1.81×10-7mol∕L。該探針與Hg2+是1∶1絡合，且絡合物的熒光在pH為4.5～8的范圍內不受影響，表明其可用于檢測活體細胞中的Hg2+，值得注意的是，在探針中加入1倍當量Hg2+后，再加入1倍當量S-會使熒光又恢復到探針原來的情況。這項工作無疑為進一步設計和開發(fā)用于環(huán)境相關毒性重金屬離子檢測的BODIPY熒光傳感器奠定了基礎。

圖3 Hg2+探針2aFig.3 Hg2+probe 2a

2.3 對Co2+的檢測

Co2+在一些生物過程中發(fā)揮著重要的作用，如血液的生成、脂肪的新陳代謝、蛋白質的形成等，但是過量的Co2+會引發(fā)一系列的健康問題，比如心臟中毒、哮喘、肺癌等，以及抑制某些酶的活性。因此，無論對環(huán)境還是生物體，對鈷的痕量檢測至關重要。2017年，SENKUYTU等［29］通過“click”反應合成得到一類基于環(huán)氧四磷腈的BODIPY類熒光探針3a～3c（圖4）。該類探針可在四氫呋喃溶液中選擇性的檢測Co2+，探針3c的最大激發(fā)波長為640 nm，最大發(fā)射波長為650 nm。以618 nm激發(fā)，其中只有Co2+對探針3c有熒光淬滅效果。同時測定了Co2+在不同濃度下對該探針的梯度效果，并且發(fā)現該分子探針與Co2+的絡合可能是按4∶1的比例進行絡合的。該探針對Co2+的最低檢測限達4.27 μmol∕L。

圖4 Co2+探針3a～3cFig.4 Co2+probe 3a-3c

2.4 對K+的檢測

K+對自然界和人都非常重要。對于已報道的K+探針，存在K+∕Na+選擇性差、成本高的缺點，因此發(fā)展選擇性高，能用于生物體系和自然環(huán)境的新型K+探針很有意義。2017年，YAN等［30］報道了冠醚對K+的選擇性絡合，設計合成了基于聚集導致熒光淬滅（aggregation-caused quenching，ACQ）效應的熒光探針4a（圖5）。在DMSO溶液中加入K+后，探針在498 nm處的吸光度逐漸降低，同時510 nm（λex=480 nm）左右熒光發(fā)射光譜被一定程度淬滅。探針在溶液V（DMSO）∶V（H2O）=1∶1中的吸光度和熒光強度都比探針在純DMSO中低許多，表明聚合導致了吸光度下降和熒光淬滅。K+通過與冠醚前體的氧原子絡合，縮短兩端BODIPY的距離從而導致聚集熒光淬滅。該探針與K+的絡合是按1∶1的比例進行，絡合常數為 4.3×105（mol∕L）-1。該探針對K+具有很好的選擇性。

圖5 K+探針4aFig.5 K+probe 4a

2.5 對Ca2+的檢測

Ca2+在機體各項生理活動中不可或缺，包括骨骼的生長、凝血過程、神經傳導等。2017年，LIU等［31］設計合成了一種基于PET機制的“off-on”型Ca2+探針5a（圖6），該探針的BDOIPY的8位連接1，2-二氨基苯氧基乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸（BAPTA），4個強電子供體4-甲氧基苯基的連接使得BODIPY的熒光發(fā)生紅移，最大發(fā)射波長為631 nm，由于氮和氧原子帶有孤對電子，當5a遇到激發(fā)光照射時，發(fā)生PET效應，使得BODIPY的熒光強度減弱，當加入Ca2+后，Ca2+與探針5a絡合，阻斷PET，導致631 nm處探針熒光增至原來的43倍，體現了探針的高靈敏性，探針在溶液體系為V（MeOH）∶V（MOPS buffer）=1∶1中對Ca2+的檢測限為39 μmol∕L。另外，該探針對環(huán)境pH有較強的惰性，在pH為5.5～8.5之間檢測效果更佳，因此，該探針對于Ca2+檢測和生物成像的應用有潛在價值。

圖6 Ca2+探針5aFig.6 Ca2+probe 5a

2.6 對Cu2+的檢測

銅是所有生物系統(tǒng)中不可缺少的微量元素，在鐵和鋅之后，排名第三。它廣泛分布在血液系統(tǒng)中，作為輔酶因子在許多細胞過程中扮演著關鍵的角色。但是，當濃度超過細胞所需水平時，會導致銅中毒，引起老年癡呆、腎衰竭以及門克斯和威爾遜疾病等。隨著含銅物質在工業(yè)和農業(yè)中的應用，環(huán)境中銅污染已經越來越嚴重。2014年，ZHANG等［32］報道了一種“off-on”型Cu2+探針6a（圖7），此探針可在水介質中對Cu2+進行檢測，通過探針與銅離子1∶1鰲合，阻止分子內電荷轉移，使得探針熒光增強，在這一過程中，探針在494 nm處吸收峰消失，在499 nm處出現新吸收峰，與此同時，探針的513 nm處的熒光強度急劇增強。探針Cu2+的檢測限為2.5×10-8mol∕L，該探針對Cu2+檢測，顯示出靈敏度高、選擇性好、簡單、快速、方便的特點，表明該探針可用于真實水樣中Cu2+的檢測。此外，探針6a可以在Hep G2細胞中對銅離子進行檢測，表示該探針對Cu2+的檢測具有在生物系統(tǒng)中應用的潛力。

2016年，YANG等［33］報道了一種可視化Cu2+探針7a（圖7）。在V（HEPES）∶V（MeCN）=1∶4，pH=7.2溶液中加入Cu2+后，探針與Cu2+是1∶1反應，探針在480 nm處吸收峰紅移至570 nm，550 nm處熒光峰紅移至600 nm，其他常見金屬陽離子對其沒有明顯干擾，熒光量子產率由0.012增至0.280，探針的檢測限達5 μmol∕L。該探針對Cu2+的檢測可以應用于BHK細胞的熒光成像研究，說明這對于環(huán)境和生理系統(tǒng)方面都有很好的應用前景。

圖7 Cu2+探針6a和7aFig.7 Cu2+probe 6a and 7a

2.7 對Au3+的檢測

2016年，WANG等［34］報道了一種可用于裸視檢測Au3+的熒光探針8a（圖8），該探針的BODIPY的6位連接單希夫堿，希夫堿是強的受電子體，當8a受到特定波長的激發(fā)光照射時，探針發(fā)生分子內的電荷轉移（intramolecular charge transfer，ICT），導致BODIPY的熒光淬滅，當加入Au3+后，Au3+通過與希夫堿的氮原子發(fā)生絡合，促進C==N雙鍵發(fā)生水解反應生成含有醛基的BODIPY，從而導致BODIPY的熒光增強。在pH=7.0，V（0.1 M PBS）∶V（EtOH）=7∶3溶液中加入Au3+后，8a吸收峰由536 nm藍移至497 nm，溶液由紫紅色變?yōu)闇\黃色，此外，熒光量子產率由0.02升至0.72，增長36倍。相比之前報道的探針，該探針對Au3+的檢測限可達60 nmol∕L，響應時間更短（90 s），對其他陽離子的抗干擾能力更強；活細胞成像時，表現出更低的細胞毒性，在較高環(huán)境溫度（25～70℃）中也可以保持自己的化學特性；此化學探針還是第一次成功的在斑馬魚上進行Au3+熒光成像的應用。

圖8 Au3+探針8aFig.8 Au3+probe 8a

2016年，WANG等［35］報道了一種反應型Au3+熒光探針9a（圖9），該探針BODIPY的8位連接苯乙炔基苯胺，由于存在PET效應，導致該探針的熒光發(fā)生淬滅，Au3+的加入，使其苯乙炔基苯胺發(fā)生環(huán)化反應生成苯基吲哚，有效抑制了PET過程，使得9a的熒光得到增強，量子產率由0.007 8增至0.180 0。該探針對Au3+響應時間小于60 min，并且可用于Au3+活細胞生物熒光成像。

圖9 Au3+探針9aFig.9 Au3+probe 9a

3 BODIPY類熒光探針對陰離子的檢測

3.1 對CN-的檢測

氰化物是劇毒物。2016年，WU等［36］報道了一種親核加成反應型CN-探針10a（圖10），經過機制研究證明，CN-與BODIPY的一個吡咯環(huán)發(fā)生親和加成反應，破壞分子的共軛體系導致其吸收光譜和熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化明顯。在THF中，加入10倍當量的CN-后，探針10a在650 nm處近紅外吸收消失，溶液顏色由深藍變成淺棕色，680 nm處熒光（λex=590 nm）被完全淬滅。該探針對CN-響應迅速（常溫小于5 min）。

圖10 CN-探針10aFig.10 CN-probe 10a

2018年，本課題組設計合成了一種基于BODIPY檢測CN-的熒光探針11a（圖11），BODIPY的8位的醛基與半花菁發(fā)生縮合反應得到探針11a，當特定波長的激發(fā)光照射時，由于存在ICT效應，導致11a的熒光強度非常弱，當探針11a與CN-發(fā)生親核加成反應后，破壞了ICT效應，導致探針分子的熒光增強，量子產率由0.015增強至0.330。該探針可在水相中檢測CN-，最低檢測限可達59 nmol∕L，響應時間非?？焖伲? s），對CN-的選擇性好［37］。

圖11 CN-探針11aFig.11 CN-probe 11a

3.2 對F-的檢測

F-在環(huán)境與生物中至關重要。2015年，FU等［38］報道了一系列的F-探針，其中F-探針12a（圖12）對F-有很好的選擇性，在V（MeCN）∶V（H2O）=95∶5溶液中，加入50倍當量F-后，F-與探針發(fā)生脫保護反應，得到末端為炔基的化合物，使其吸收峰從670 nm藍移至490 nm，熒光發(fā)射峰從687 nm藍移至570 nm處，熒光增強至原來40倍，檢測限達92.7 nmol∕L；對于F-探針12b（圖12），探針熒光量子產率為0.44，檢測F-時，探針吸收峰從630 nm藍移至464 nm，熒光發(fā)射峰從624 nm藍移至542 nm，熒光強度增至原來的7倍，檢測限達22.9 nmol∕L，在365 nm紫外燈下溶液熒光顏色由紅色變成黃色，響應時間小于20 min。

圖12 F-探針12a和12bFig.12 F-probe 12a and 12b

3.3 ClO-的檢測

2017年，LI等［39］報道了一種反應型ClO-熒光探針13a（圖13），該探針BODIPY的6位連接2，4-二硝基苯肼，C==N 鍵的形成導致BODIPY熒光的淬滅，在pH=7.4，V（0.01 M PBS）∶V（DMF）=1∶1溶液中加入ClO-，使其發(fā)生親核加成反應，促使C==N鍵水解得到6-醛基BODIPY，從而導致探針13a的吸收峰由543 nm藍移至505 nm，溶液顏色由粉色變?yōu)闇\棕色，因此對ClO-的定性檢測可直接通過肉眼觀察；在515 nm處出現熒光峰，熒光量子產率由0.059增至0.560。該探針對ClO-響應迅速（響應時間小于7 min），且其他陰離子無干擾，該探針可應用于生活用水和活細胞（比如Hep G2細胞）中檢測ClO-。

圖13 ClO-探針13aFig.13 ClO-probe 13a

3.4 對HSO4-的檢測

2016年，WANG等［40］報道了一種“off-on”型HSO4-探針14a（圖14），該探針BODIPY的6位連接希夫堿，在特定激發(fā)光的照射下，14a由于存在ICT效應，導致熒光強度非常弱，在V（THF）∶V（H2O）=8∶1溶液中，加入HSO4-后，HSO4-由于在水中可電離出氫離子，酸性條件下促進C==N鍵發(fā)生水解反應，生成6-醛基BODIPY，從而導致探針分子14a的吸收峰從523 nm藍移至497 nm，其A497nm∕A526nm的比值增長150倍，溶液顏色由粉色變?yōu)辄S色，并且探針從533 nm處幾乎沒有熒光增強至原來114倍，探針檢測HSO4-是探針與其1∶1進行的反應，對HSO4-的檢測可以達到6.45×10-8mol∕L。此外，細胞成像實驗表明，探針可以應用在Hela細胞中，對HSO4-進行監(jiān)測。

圖14 HSO4-探針14aFig.14 HSO4-probe 14a

4 BODIPY類熒光探針對小分子的檢測

BODIPY探針可以用于檢測小分子，比如NO、H2O2、硫醇等。以硫醇為例，其分子量低，苯硫酚（PhSH）和脂肪族硫醇在化學化工和生物系統(tǒng)中的地位很重要。對人而言，細胞內硫醇濃度的改變會引起各種疾病，如肝損傷、阿爾茲海默癥、心血管疾病等。另一方面，苯硫酚在有機合成中發(fā)揮重要作用，廣泛應用于制備化學品、藥品、工業(yè)產品等。然而，苯硫酚及其衍生物有劇毒，長期接觸苯硫酚可能嚴重損害中樞神經等，也可導致呼吸增加、肌肉無力、后肢癱瘓、昏迷、甚至死亡。因此，有選擇性地將有毒的苯硫酚從生物學上重要的脂肪族硫醇中區(qū)分出來，在生物科學領域有相當大的意義。

2017年，LIU等［41］報道了一種反應型苯硫酚熒光探針15a（圖15），該探針為單氯代BODIPY，在BODIPY的3位引入甲酰胺，控制15a的反應活性，使其5位的氯可選擇性地與苯硫酚發(fā)取代反應，在pH=7.4，V（乙腈）∶V（HEPES buffer）=1∶3溶液中檢測PhSH時，518 nm吸收峰紅移至558 nm，可通過肉眼觀察到溶液由橙色變?yōu)榉凵?，熒光發(fā)射峰從540 nm紅移至581 nm，其F581nm∕F540nm的比值從0.21增至135.18，增長650倍，檢測限達36.9 nmol∕L，在365 nm紫外燈下溶液顏色由綠色變?yōu)辄S色熒光。探針對PhSH的響應迅速，可以實現在水溶液中對PhSH的檢測，該探針還可應用于細胞熒光成像。

圖15 PhSH探針15aFig.15 PhSH probe 15a

5 BODIPY類熒光探針在生物檢測方面的應用

近年來，熒光標記多肽被廣泛應用于蛋白質的檢測。2017年，RAMON等［42］報道了一種標記細胞凋亡小體中的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的熒光Trp-BODIPY環(huán)狀肽16a（圖16），16a與PS具有很強的親和力，當它與PS絡合后，熒光強度明顯增強。不同于膜聯蛋白，Trp-BODIPY環(huán)肽可在不依賴Ca2+時對PS有很強的親和力，其可適用于很多生理條件下的標記試驗。在體外磷脂單分子層試驗中，16a可跟蹤顯示脂質-水分成分的變化。流式細胞實驗通過16a從BL2人體淋巴瘤細胞中確認對凋亡小體的標記，這對在多種生物環(huán)境下去監(jiān)測、描述亞細胞結構提供了一個新機會。

圖16 Trp-BODIPY環(huán)狀肽16aFig.16 Trp-BODIPY cyclic peptide 16a

2017年，LI等［43］報道了一類基于BODIPY-三苯胺型檢測牛血清白蛋白（BSA）的新型探針17a～17c（圖17），它們的光學物理性質見表1。探針17a～17c可以在水含量達到80%的溶液中檢測BSA，檢測BSA是熒光增敏現象，17c對BSA良好的檢測是由于強烈的共價鍵分子之間的相互作用，其中17a已經成功應用于SK-BR-3細胞成像。

圖17 BSA探針17a～17cFig.17 BSA probe 17a-17c

2018年，GONG等［44］報道了GSH（谷胱甘肽）比率型熒光探針18a（圖18），GSH是生命系統(tǒng)中重要成分，主要起抗氧化、抗衰老作用。GSH異常下降，會引起小孩智力遲鈍、肝損傷、阿爾茲海默癥、癌癥、糖尿病、心血管疾病等。因此，發(fā)展新的檢測GSH的方法對評估和診斷疾病很重要。探針18a對GSH的檢測是對氯的兩步親核取代反應。第一階段，在GSH在0～1倍當量時，溶液體系為DMSO∕H2O（PBS buffer，V∕V=1∶9，pH=7.4）進行的，誘導熒光顏色由綠色（λem=530 nm）變?yōu)辄S色（λem=562 nm）（I562nm∕I530nm，單取代），加入過量GSH引起第二階段熒光顏色變化，從黃色（λem=562 nm）變?yōu)榧t色（λem=597 nm）（I597nm∕I562nm，雙取代），探針GSH的反應靈敏，也成功的應用于指導GSH的細胞成像，對細胞內不同濃度的谷胱甘肽有很好的響應。

表1 探針17a～17c的光學物理性質Tab.1 Photophysical properties of probe 17a-17c

圖18 GSH探針18aFig.18 GSH probe 18a

6 結論與展望

綜上所述，BODIPY作為一類新型的熒光染料，有著優(yōu)良的光學性質，并且易于官能化衍生出具有不同功能的熒光探針，可以特異性識別各類陰陽離子，小分子以及蛋白質等，很大程度上滿足實際應用的需要。隨著研究的深入，BODIPY類染料顯示出良好的前景，但是依舊存在一些問題需要進一步對BODIPY進行改進。一方面是在已報道的BODIPY探針中很少有近紅外熒光發(fā)射波長的探針，而且部分探針的選擇性和靈敏度有待提高。比率型熒光探針由于可以消除環(huán)境、儀器和操作誤差使其性能遠遠優(yōu)于熒光淬滅或增強型熒光探針，但是在已報道的熒光探針中，比率型探針相對較少。另一方面，在生物應用中，BODIPY的生物相容性也是一個待解決的問題。因此，發(fā)展基于BODIPY的比率型近紅外熒光探針和生物環(huán)境相容性好的熒光探針是今后的研究熱點。