任桂靜，唐峰華，馬春艷，張鳳英，馬凌波

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

柔魚科（Ommastrephidae）隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）頭 足 綱 （Cephalopoda）槍 形 目（Teuthoidea），一般根據(jù)形態(tài)特征劃分為柔魚亞科（Ommastrephinae）、褶柔魚亞科（Todarodinae）、滑柔魚亞科（Illicinae），共計(jì)11屬23種，大多為大洋性種類，十分強(qiáng)壯，游泳迅速［1］。柔魚亞科主要分類特征為漏斗淺穴內(nèi)生縱褶，兩側(cè)具邊囊，具皮下、內(nèi)臟和眼球發(fā)光器，一般認(rèn)為柔魚亞科是柔魚科進(jìn)化較晚的一個(gè)類群，包括6屬9種（圖 1，圖 2，表 1）［1－2］。隨著我國遠(yuǎn)洋漁業(yè)不斷發(fā)展，柔魚等重要經(jīng)濟(jì)種類的生物學(xué)特征、資源動(dòng)態(tài)、漁場(chǎng)環(huán)境等已經(jīng)積累了較多的研究資料［3－6］。對(duì)柔魚亞科系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究主要以形態(tài)學(xué)為主［2，7－10］。

目前DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于頭足類研究的許多領(lǐng)域，包括種群結(jié)構(gòu)分析、物種鑒定、新種的發(fā)現(xiàn)、系統(tǒng)進(jìn)化和生物多樣性研究。SALES等［11］利用16S和COI基因條碼，結(jié)合一個(gè)核基因標(biāo)記（Rhodopsin基因），發(fā)現(xiàn)槍烏賊科的普氏槍烏賊（Doryteuthis plei）、皮氏槍烏賊（Doryteuthis pealei）、杜 氏 槍 烏 賊 （Uroteuthis duvauceli）和萊氏擬烏賊（Sepioteuthis lessoniana）均可能存在隱蔽種。MERIAM等［12］利用COI序列研究了烏賊（S．officinalis）的群體遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)。WAKABAYASHI等［13］利用16S和COI基因條碼片段探討了柔魚科的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。YOSHIDA等［14］利用線粒體12S、16S和 COI基因片段研究了烏賊科的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

近年來，貝葉斯聯(lián)合模型分析多基因片段的方法廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究中［15－16］，聯(lián)合多基因片段分析能有效地增加系統(tǒng)發(fā)生分析的信號(hào)強(qiáng)度和置信度，并為不同進(jìn)化速率的片段選擇最適進(jìn)化模型和分組方法。運(yùn)用貝葉斯法（BI）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，通過“聯(lián)合”途徑獲得的結(jié)果更可能接近正確的物種樹［17－18］。本研究擬利用線粒體COI和16S rRNA基因條形碼技術(shù)，選取柔魚亞科7個(gè)種（圖2）［19］，以太平洋褶柔魚和滑柔魚為外群，構(gòu)建貝葉斯聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)分類特征，探討柔魚亞科各種的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其研究結(jié)果可為柔魚等資源的保護(hù)和利用提供分子水平資料。

1 材料與方法

圖1 柔魚亞科各屬系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系樹（仿 ROELEVELD［2］）Fig．1 Phylogenetic tree of the Ommastrephinae（Figure based on ROELEVELD［2］）

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用柔魚亞科樣品共8尾，3尾柔魚樣品于2013年9月中旬遠(yuǎn)洋捕撈船采自北太平洋區(qū)域（42°56′N、158°45′E），2尾莖柔魚樣品于2013年9月中旬遠(yuǎn)洋捕撈船采自秘魯外海，1尾鳶烏賊樣品于2013年3月上旬采自我國南海，2尾發(fā)光柔魚（Eucleoteuthis luminosa）樣品于2015年8月底遠(yuǎn)洋捕撈船采自千島群島附近（45°N、155°E）。以柔魚科另外兩個(gè)亞科的代表種—1尾太平洋褶柔魚（Todarodes pacificus）（褶柔魚亞科，2015年12月底采自日本海）、1尾阿根廷滑柔魚（Illex argentinus）（滑柔魚亞科，2015年7月底采自阿根廷近海）作為外群（表1）。所有樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后取肌肉組織用95%乙醇固定，在－20℃條件下保存?zhèn)溆?。從GenBank上取得玻璃烏賊（Hyaloteuthis pelagica）、鳥柔魚、大西洋鳥柔魚（Ornithoteuthis antillarum）的序列參與分析。

圖2 本研究涉及的柔魚亞科7個(gè)種Fig．2 7 species of Ommastrephinae in this study

表1 本研究所用樣品信息Tab．1 Information of species used in this study

1．2 基因組DNA提取、片段序列測(cè)定

取柔魚肌肉100 mg左右，用海洋動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴(kuò)增 COI基因的引物為 LCO1490：5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’和HCO2198：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’［20］；用于擴(kuò)增 16S rRNA基因的引物為16Sar：5’-CGCCTG TTTAAC AAA AAC AT-3’和 16Sbr：5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’［21］。PCR反應(yīng)體系總體積為 25μL，其中：10×buffer 2．5μL，MgCl21．5 mmol·L－1dNTP 200μmol·L－1引物各 0．2μmol·L－1，Taq酶1．25 U，模板 DNA 1μL，加滅菌蒸餾水至25μL。PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler 5333擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45 s，52℃退火45 s，72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。

以上反應(yīng)均用陰性對(duì)照來檢查是否有DNA污染。取1．5μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海杰李生物科技有限公司測(cè)序。

1．3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Dnastar軟件包 （DNASATR，Inc．，Madison，USA）對(duì)所有序列進(jìn)行編輯和排序校對(duì)。再應(yīng)用Clustal X1．83對(duì)得到的序列進(jìn)行序列比對(duì)。各種序列的多態(tài)性使用Arlequin（Ver．3．11；Excoffier等［22］）軟件進(jìn)行分析。在 AIC（Akaike Information Criterion）標(biāo)準(zhǔn)下，使用MrModeltest 2．0選擇 DNA序列最佳替換模型［23］，運(yùn)用 MrBayes v 3．1．2中的貝葉斯演繹法（Bayesian Inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［24］。采用 MCMC（Markov Chain Monte Carlo）算法，以隨機(jī)樹為起始樹，運(yùn)行100000代，每100代取樣1次，開始的250個(gè)樣本作為老化樣本（burn-in samples）舍棄。采用分劃同質(zhì)性檢驗(yàn)（partition homogeneity test）評(píng)價(jià)線粒體COI和16S rRNA基因片段聯(lián)合分析的可靠性［25］。運(yùn)用MrModeltest 2．0軟件分別對(duì)以上2個(gè)基因片段及COI編碼片段的第1、2、3密碼子進(jìn)行分析，獲得最適合本研究序列矩陣的核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù)，選擇合適的分組方法，聯(lián)合2個(gè)基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2．1 各基因片段獨(dú)立分析

獲得了柔魚亞科6個(gè)種的部分COI和16S rRNA基因片段，下載GenBank數(shù)據(jù)庫中的玻璃烏賊、鳥柔魚、大西洋鳥柔魚的相關(guān)序列，分析了9個(gè)種的COI和16S rRNA 2個(gè)基因片段的部分序列。COI基因共得到612 bp的序列，檢測(cè)到206個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占總序列的33．7%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)173個(gè)，沒有出現(xiàn)堿基的插入缺失，轉(zhuǎn)換顛換比（TS／TV）為2．3；在16S rRNA基因459 bp的基因位點(diǎn)上，發(fā)現(xiàn)71個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占總序列的15．5%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)50個(gè)，插入缺失8個(gè)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換顛換比為2．1。2個(gè)片段的轉(zhuǎn)換顛換比都大于 2，說明都尚未飽和［26］。

以阿根廷滑柔魚、太平洋褶柔魚為外群，運(yùn)用最適模型構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。基于COI基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，運(yùn)用了最適應(yīng)模型HKY＋I(xiàn)＋G。結(jié)果顯示發(fā)光柔魚先依次與鳶烏賊、玻璃烏賊、莖柔魚聚為一大支，然后再與柔魚聚合，而鳥柔魚屬兩個(gè)種（鳥柔魚和大西洋鳥柔魚）形成一個(gè)單系群（monophyly）且與以上各種分化較大，外群的兩個(gè)種顯示了與以上各種較大的遺傳分化，同時(shí)該系統(tǒng)樹種間各分支都具有較高的后驗(yàn)概率（0．75～1）（圖3）；基于16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，運(yùn)用了最適應(yīng)模型GIR＋I(xiàn)。結(jié)果顯示了較大的差異，首先柔魚與鳶烏賊聚為一支，然后依次與玻璃烏賊、莖柔魚，聚為一大支再與發(fā)光柔魚聚合，且鳥柔魚屬兩個(gè)種形成一個(gè)單系群，表現(xiàn)出與太平洋褶柔魚關(guān)系較近，該系統(tǒng)樹各分支的后驗(yàn)概率方面除發(fā)光柔魚外，其余種間后驗(yàn)概率過低（0．21～0．39）拓?fù)潢P(guān)系可信度較低（圖 4）。

2．2 片段聯(lián)合分析

線粒體COI和16S rRNA基因片段同質(zhì)性檢驗(yàn)的結(jié)果顯示P值為0．52，說明這2個(gè)基因片段可以進(jìn)行序列聯(lián)合分析。COI基因?yàn)榫幋a基因片段，其第1、2密碼子高度保守，而第3密碼子容易發(fā)生堿基替換，因此大部分系統(tǒng)發(fā)生信息存在于第3密碼子。將編碼片段COI的第1、2和3密碼子分別運(yùn)用MrModeltest2．0軟件分析，獲得最適合本研究序列矩陣的核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù)（表2）。因此COI第1、2密碼子序列為一組；第3密碼子序列為一組；16S rRNA序列單獨(dú)為一組。根據(jù)分組方法和不同分區(qū)的最適進(jìn)化模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。序列聯(lián)合分析系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)為發(fā)光柔魚依次與鳶烏賊、玻璃烏賊、莖柔魚聚為一大支，然后與柔魚聚合，鳥柔魚屬兩個(gè)種（鳥柔魚和大西洋鳥柔魚）兩個(gè)種形成一個(gè)單系群且與以上各種分化較大，外群的兩個(gè)種顯示了與本研究各種較大的遺傳分化。聯(lián)合分析得到的系統(tǒng)樹上各分支后驗(yàn)概率很高，都接近于1（圖5）。

圖3 基于COI基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．3 Bayes phylogenetic tree of Ommastrephinae based on partial COI gene

圖4 基于16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．4 Bayes phylogenetic tree of Ommastrephinae based on partial 16S rRNA gene

3 討論

位于線粒體基因的16S rRNA和COI基因條碼是海洋生物分子系統(tǒng)研究中常用的分子標(biāo)記，本研究基于這兩個(gè)基因片段分別構(gòu)建了柔魚亞科系統(tǒng)發(fā)生樹。研究結(jié)果的差異主要集中在兩方面：1）在鳥柔魚屬分類地位問題上，基于16S rRNA基因片段的系統(tǒng)樹顯示鳥柔魚屬兩個(gè)種，脫離了柔魚亞科范圍，表現(xiàn)出與太平洋褶柔魚關(guān)系較近，這種結(jié)果與 WAKABAYSHI等［13］研究結(jié)果相同，但基于COI基因片段的系統(tǒng)樹卻顯示鳥柔魚屬兩個(gè)種仍然與柔魚亞科其它種聚為一大支，這兩種結(jié)果都具有很高的后驗(yàn)概率。2）在除鳥柔魚屬外，柔魚亞科內(nèi)部系統(tǒng)關(guān)系問題上，基于COI基因片段的系統(tǒng)樹各分支具有較高的后驗(yàn)概率（0．72～1），具有較高的可信度，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示柔魚和莖柔魚親緣關(guān)系較近，且為分化較早的種類，而發(fā)光柔魚、鳶烏賊和玻璃烏賊親緣關(guān)系較近，為柔魚亞科分化較晚的種類，而基于16S rRNA基因片段的系統(tǒng)樹各分支的后驗(yàn)概率方面除發(fā)光柔魚（值為1）外，其余種間后驗(yàn)概率過低（0．21～0．39），拓?fù)潢P(guān)系可信度較低。線粒體16S rRNA基因因其較為保守而被較多地用于種以上階元的系統(tǒng)發(fā)育研究［27－29］，而本研究結(jié)果顯示其在柔魚亞科屬間的分析可能存在一定的局限。WAKABAYSHI等［13］基于16S rRNA基因片段運(yùn)用3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹柔魚亞科內(nèi)部同樣支持率過低，證實(shí)了以上觀點(diǎn)。

表2 不同分區(qū)及其最適進(jìn)化模型和所包含位點(diǎn)數(shù)Tab．2 Data partitions，estimated models of sequence evolution and total number of characters of each partition

由COI片段獨(dú)立分析得到的結(jié)果與聯(lián)合兩個(gè)基因條碼構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)果一致，可信度均接近100%。因此我們以此分析結(jié)果討論。鳥柔魚屬在以往大部分研究中因其出現(xiàn)內(nèi)臟發(fā)光器和漏斗淺穴邊囊等特征，被歸入柔魚亞科［2，29－31］，本研究結(jié)果支持以上觀點(diǎn)，將鳥柔魚屬仍然歸入柔魚亞科，但屬于柔魚亞科中最原始種類。JEREB等［7］研究認(rèn)為柔魚科種類在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了陸架坡、淺洋性、完全大洋性三個(gè)階段。鳥柔魚屬種類屬淺洋性種類，本研究結(jié)果顯示鳥柔魚屬可能是褶柔魚亞科向柔魚亞科進(jìn)化過程中的過渡物種。

圖5 基于COI和16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．5 Bayes phylogenefic tree of Ommastrephinae based on partial COI and 16S rRNA gene

在以往的形態(tài)學(xué)研究中，如ROELEVELD［2］、ZUEV等［8］認(rèn)為玻璃烏賊屬、發(fā)光烏賊屬親緣關(guān)系較近，最顯著的形態(tài)特征是外套膜上都具有特化的大型發(fā)光器（玻璃烏賊屬具圓斑點(diǎn)，發(fā)光烏賊屬具條狀）（圖2），而鳶烏賊與莖柔魚屬親緣關(guān)系近。但是，基于分子數(shù)據(jù)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊親緣關(guān)系較近。通過仔細(xì)研究鳶烏賊屬形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)其外套膜后背前部一大塊皮下發(fā)光器的集聚，形成一個(gè)大型發(fā)光器（圖2）。整個(gè)柔魚科種類中只有玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊3屬均有外套膜大型發(fā)光器［7］，可見本研究結(jié)果有一定的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

本研究中柔魚與其它柔魚亞科種類存在較大的遺傳距離（枝長(zhǎng)較長(zhǎng)），可能提示有其獨(dú)特的進(jìn)化路徑。從發(fā)光器這一特征來看，柔魚屬種類只有外套膜皮下發(fā)光器，這與柔魚亞科其它種類具有較大差別（其它種類包括最原始的鳥柔魚都具有內(nèi)臟和眼球發(fā)光器），ROELEVELD［2］研究認(rèn)為這是柔魚亞科某祖先種在進(jìn)化過程中丟失了內(nèi)臟和眼球發(fā)光器，產(chǎn)生了外套膜皮下發(fā)光器，進(jìn)而形成了柔魚屬種類。本研究顯示柔魚與其它柔魚亞科種類存在較大的遺傳距離，可能預(yù)示著柔魚亞科種類一個(gè)新的進(jìn)化方向。

綜上所述，玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊親緣關(guān)系較近，是柔魚亞科中分化較晚的種類，其次為莖柔魚、柔魚，鳥柔魚屬兩個(gè)種為柔魚亞科中最原始種類，且為褶柔魚亞科向柔魚亞科進(jìn)化過程中的過渡物種。本研究同時(shí)顯示了各類發(fā)光器在柔魚亞科系統(tǒng)發(fā)育研究中具有非常重要的進(jìn)化意義。但由于本研究樣品種類尚不完善，研究所用線粒體DNA是母系遺傳，僅能反映母本的遺傳特征，并且其各基因片段進(jìn)化速率差異較大。今后有必要增加核基因標(biāo)記的研究，并結(jié)合更多形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步完善柔魚亞科分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。