應(yīng)寒松，鐘世歡，裘鈞陶，葉佳明

（浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

卡巴氧和喹乙醇同屬于喹噁啉類化合物，是促生長(zhǎng)作用的飼料添加劑，能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，對(duì)魚類致病菌具有抑制作用，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的促生長(zhǎng)和疾病防治。毒理學(xué)研究表明，卡巴氧和喹乙醇具有致癌致畸的毒副作用[1]，因此世界上大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用卡巴氧和喹乙醇，我國(guó)也明文規(guī)定禁止將喹乙醇和卡巴氧用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。喹乙醇和卡巴氧能在動(dòng)物組織內(nèi)迅速代謝產(chǎn)生的相應(yīng)代謝物3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸（MQCA） 和喹噁啉- 2 -羧酸（QCA），是二者監(jiān)控常用的目標(biāo)殘留物。

目前水產(chǎn)品中MQCA和QCA常用的檢測(cè)方法有液相色譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]和氣相色譜-質(zhì)譜法[4]。液質(zhì)聯(lián)用的方法由于儀器昂貴、檢測(cè)成本高而不易推廣。液相色譜法[5]目前使用酶水解提取，前處理步驟較為復(fù)雜，回收率偏低。研究通過簡(jiǎn)化前處理過程，通過酸水解前處理并使用固相萃取方法進(jìn)行凈化，研究建立適用于鯽魚組織中MQCA和QCA測(cè)定的高效液相色譜法，為卡巴氧和喹乙醇代謝物檢測(cè)提供靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

鯽魚，用組織研磨儀研磨，混合均勻。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸（純度99.0%）、喹噁啉-2 -羧酸（純度99.8%）、試驗(yàn)用水為超純水，Dr.Ehrenstorfer公司提供；OasisMAX固相萃取柱（60 mg/3 mL），Waters公司提供。

1.1.2 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器、AR2140型電子分析天平、IKA VORTEX GENIU 3型渦旋混合器、TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)、KS-300EI型超聲波清洗器、氮吹儀等。

1.2.1 提取

稱取5 g（精確至0.01 g） 樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，渦旋混勻后超聲提取10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)操作1次，合并提取液，加入10 mL正己烷，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取下層水相，待用。

1.2.2 凈化

將MAX固相萃取柱依次用2 mL甲醇、3 mL水活化，待試劑流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速在3 mL/min以下。先后用3 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL 2%含甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫，洗脫液在40 ℃下氮吹吹干，用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速14 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液供液相色譜測(cè)定。

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 nm，4.6 μm），流動(dòng)相：1%甲酸水溶液和甲醇（甲酸水+甲醇=6+4）， 流速1 mL/min， 柱溫30 ℃， 進(jìn)樣量20 μL，波長(zhǎng)320 nm。

2 結(jié)果與分析

目前MQCA，QCA的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-3-2006《動(dòng)物源食品中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》，該方法前處理步驟較多，采用該法再萃取和反萃取中，目標(biāo)物容易損失，造成回收率偏低。試驗(yàn)優(yōu)化提取步驟，用鹽酸提取。試驗(yàn)分別以HCl濃度和酸解時(shí)間對(duì)水解過程進(jìn)行研究，用0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mol/L的HCl溶液進(jìn)行水解；水解時(shí)間選擇10，20，30，40 min。試驗(yàn)結(jié)果表明，1 mol/L HCl溶液水解10 min即可將目標(biāo)物從組織中提取出來(lái)。

魚肉組織樣品經(jīng)鹽酸提取正己烷去脂后，提取液含較多雜質(zhì)，會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，采用固相萃取柱凈化后，能降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高儀器靈敏度。根據(jù)MQCA，QCA的結(jié)構(gòu)，分別選擇陰離子交換固相萃取柱（Oasis MAX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）進(jìn)行凈化效果考查。試驗(yàn)結(jié)果顯示，HLB柱凈化回收率為MQCA可達(dá)82.7%±2.5%，QCA可達(dá)79.3%±2.8%，MAX柱凈化回收率為MQCA可達(dá)93.5%±1.6%，QCA可達(dá)94.6%±2.1%，二者均能滿足MQCA，QCA的分析要求。二者比較，MAX柱回收率更高，因此選用MAX柱作為凈化萃取柱。

分別配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00 μg/mL 進(jìn)行分析， 根據(jù)保留時(shí)間定性，使用峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

MQCA、QCA的質(zhì)量濃度在0.05～2.00 μg/mL時(shí)呈線性分布，其中QCA線性回歸方程為Y=38.453 29X-0.117 32，相關(guān)系數(shù)為0.999 96；MQCA線性回歸方程為Y=26.435 17X+0.339 17，相關(guān)系數(shù)為0.999 97。采用空白基質(zhì)添加MQCA，QCA標(biāo)準(zhǔn)品的方法，以3倍信噪比計(jì)算檢出限MQCA，QCA為4.0 μg/kg。

0.5 μg/mL的MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1 0.5 μg/mL的MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)色譜

選取鯽魚樣品，添加不同含量的MQCA，QCA標(biāo)準(zhǔn)品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定6份。

精密度與回收率見表1。

表1 精密度與回收率

由表1可知，QCA回收率為83.3%～88.5%，MQCA回收率為85.6%～90.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。結(jié)果表明，此方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)使用酸水解提取鯽魚組織中MQCA，QCA，比較了不同濃度鹽酸提取效果，通過陰離子固相萃取柱凈化后，降低了基質(zhì)效應(yīng)，空白樣品加標(biāo)回收和重復(fù)性良好。通過研究，建立了鯽魚組織中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的高效液相色譜法，可用于鯽魚樣品中喹乙醇代謝物和卡巴氧代謝物的定量分析和日常檢測(cè)。