黃 海，列才華，梁蘭青，屈 姍，郭志勇

IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是一種多基因疾病,遺傳因素的確切作用仍然難以捉摸。越來越多的證據(jù)表明IgAN發(fā)病機(jī)制中IgA1分子的異常半乳糖化[1],半乳糖基轉(zhuǎn)移酶核心1β3-Gal-T及其分子伴侶Cosmc在IgA1分子的β1,3糖基化中發(fā)揮重要作用[2],核心 1結(jié)構(gòu) Galβ1→3GalNAcα1-R 由GalNAcα1-R通過核心1尿苷二磷酸-半乳糖：Gal-NAc-α-Rβ1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(核心 1β3-Gal-T)的作用合成,編碼該酶的基因是C1GALT1(GeneID：56913)[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)核心1β3-Gal-T活性需要表達(dá)命名為Cosmc(核心1β3-Gal-T特異性分子伴侶)的分子伴侶[4],其編碼基因是 C1GALT1C1(GeneID：29071),C1GALT1C1基因的突變能夠顯著改變C1β3Gal-T的酶活性[5]。本研究探索C1GALT1和C1GALT1C1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)對新疆地區(qū)維吾爾族人群IgAN易感性的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 本研究納入1 014名新疆地區(qū)維吾爾族人,其中595例經(jīng)腎活檢證實(shí)為IgAN,419例為民族和地理分布相同血尿分析正常的健康對照者。納入標(biāo)準(zhǔn)：IgAN的診斷通過免疫熒光檢測觀察IgA在腎小球系膜中的顆粒沉積,以及在系膜超微結(jié)構(gòu)檢查中電子致密物質(zhì)的沉積來證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有過敏性紫癜,系統(tǒng)性紅斑狼瘡和慢性肝病的患者。腎活檢時患者的年齡：12～76(30.6±10.7)歲；性別比例：(男∶女)＝(1.29∶1)。 IgAN 患者的腎小球?yàn)V過率通過腎臟疾病飲食改良縮寫方程估算。

該基因研究方案經(jīng)新疆軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),并獲得所有參與者的基因研究書面同意書。

1.2 基因研究方案 首先,掃描C1GALT1基因和C1GALT1C1基因來鑒定子樣本中的所有多態(tài)性,然后選擇單體型標(biāo)簽SNPs。其次,在IgAN患者組和對照組中進(jìn)一步對htSNP進(jìn)行基因分型。然后使用基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析來檢測其多態(tài)性可能對IgAN的影響。

1.3 SNPs檢測 通過鹽析程序從乙二胺四乙酸-抗凝全血樣品中提取患者的基因組DNA。參考序列C1GALT1基因和C1GALT1C1基因獲自美國國家生物技術(shù)信息中心基因數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)。對于C1GALT1基因,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增來自24個樣品(包括12個不相關(guān)的IgAN患者和12個不相關(guān)的健康對照)的基因組DNA,并直接測序以篩選SNP。PCR擴(kuò)增區(qū)域包括具有50～100 bp的側(cè)翼內(nèi)含子序列,5′和3′非翻譯區(qū)以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 kb的每個外顯子。為了篩選C1GALT1C1基因內(nèi)的變異,招募了46名個體,包括27名患有IgAN(6名女性患者)患者和19名正常對照者(6名女性對照)。C1GALT1C1基因的外顯子從46個個體的58個染色體中擴(kuò)增出來。通過Primer3程序設(shè)計(jì)PCR引物。在20 μL最終反應(yīng)體積中,通過PCR從50 ng基因組DNA中擴(kuò)增靶序列。使用ABI PRISM 3700自動測序儀(美國PE ABI公司)對產(chǎn)物進(jìn)行測序,并用Phred/Phrap/Consed軟件包進(jìn)行分析。使用Polyphred29檢測多態(tài)性位點(diǎn)并手動確認(rèn)。

1.4 基因分型 通過htSNPer1.0選擇常見SNP(具有次要等位基因頻率＞10%的SNP)作為htSNP。根據(jù)單倍型多樣性進(jìn)行軟件應(yīng)用,在一個模塊中,這個定義要求htSNPs應(yīng)該解釋多樣性不低于0.8的閾值。在C1AGLT1基因中,5個標(biāo)記SNP,被命名為SNP1(-734C/T),SNP4(-465A/G),SNP6(-330G/T),SNP7(-292C/-)和 SNP8(1365G/A)進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過定向測序?qū)NP8進(jìn)行基因分型,并且通過標(biāo)準(zhǔn)PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法在所有1 160個受試者中對另外4個SNP進(jìn)行基因分型。表1列出了引物和限制性核酸內(nèi)切酶。每個SNP位點(diǎn)的40個PCR產(chǎn)物被重新測序以準(zhǔn)確確認(rèn)PCR限制性片段長度多態(tài)性分析。

表1 C1GALT1基因SNP的引物和限制性內(nèi)切酶

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。Fisher精確檢驗(yàn)用于確定基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。將每個SNP之間的配對連鎖不平衡量化為由GLOD軟件包測量的D′和Δ2。使用Haplo.Stats1.2.0軟件測試統(tǒng)計(jì)推斷的單倍型與IgAN的關(guān)聯(lián)。通過Bonferroni校正來調(diào)整P值的水平。由于本研究中的單倍型是通過估計(jì)構(gòu)建的,所以綜合P值是通過使用軟件置換測試經(jīng)驗(yàn)性地評估的。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)性檢測 C1GALT1基因內(nèi)的9個SNPs在24個個體中被鑒定。7個SNP(SNP1-SNP7)分別位于第一個轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游的位置-734,-722,-552,-465,-449,-330和-292的 5′側(cè)翼區(qū),2個 SNP(SNP8,SNP9)分別定位于3′非翻譯區(qū)1365和1484位。在C1GALT1基因啟動子區(qū)檢測到一個插入/缺失SNP(-292C/-)。3個SNP,-722G/T,-552A/G,-465A/G,是dbSNP數(shù)據(jù)庫的新型SNP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)。表2列出了所有SNP的詳細(xì)信息以及次要等位基因頻率。

表2 C1GALT1基因多態(tài)性檢測結(jié)果

2.2 連鎖不平衡分析 C1GALT1基因中9個SNP的成對連鎖不平衡系數(shù)(D′)和相應(yīng)的P值(表3)。通過Bonferroni校正(P＜0.05/＝0.0014)。字體加粗區(qū)域表明C1GALT1基因內(nèi)存在顯著的連鎖不平衡(P＜0.0014)。通過htSNPer 1.0軟件選擇SNP1(-734C/T),SNP4(-465A/G),SNP6(-330G/T),SNP7(-292C/-)和SNP8(1365G/A)5個多態(tài)性位點(diǎn)作為關(guān)聯(lián)研究中進(jìn)一步調(diào)查的SNP標(biāo)記。

表3 C1GALT1基因連鎖不平衡分析

在46名招募個體(包括12個女性個體總共58個X染色體)的C1GALT1C1基因的外顯子中僅鑒定到1個SNP T393A(rs17261572)。A等位基因在1名IgAN患者和1名健康對照者中被鑒定,并且AA基因型在1名女性患者中被鑒定。因此,SNP的A等位基因頻率是0.069(4/58)。由于標(biāo)簽SNP的次要等位基因頻率應(yīng)大于0.10,C1GALT1C1基因中的T393A SNP不包括在關(guān)聯(lián)研究的進(jìn)一步分析中。

2.3 IgAN患者和正常對照者的多態(tài)性 關(guān)聯(lián)分析分別針對每個SNP進(jìn)行,然后進(jìn)行基于單倍型的分析。比較了IgAN患者和正常對照組之間的等位基因和基因型頻率。SNP分析結(jié)果顯示(表4)SNP7位點(diǎn)I等位基因頻率顯著低于對照組(0.091 vs 0.129,χ2＝9.827,P＝0.004)；SNP7 II/DI基因型在患者中明顯較少(0.179 vs 0.243,χ2＝9.130,P＝0.007)；其他4個SNPs的等位基因和基因型在2組之間都無顯著差異(P＞0.05)。

表4 IgAN患者和正常對照者的多態(tài)性

2.4 IgAN患者和正常對照者的單體型 通過haplo.cc(在haplo.stats程序中實(shí)施)分析,已經(jīng)計(jì)算了IgAN易感性與由5個 SNP的不同數(shù)目(2～5個SNP范圍)組成的單倍型的不同意義。除第1個SNP外,其余4個SNP得分最大,調(diào)整后總體得分(50.122)和最小全局P值(P＝5.950×10-7)。通過置換測試(2萬個置換)測試了IgAN患者與對照組之間單體型頻率分布的全球差異。發(fā)現(xiàn)2組間單體型頻率有顯著的總體差異(P＝0)。單倍型YATIG(Y＝C或T)頻率明顯低于對照組(0.0726 vs 0.1202,t＝8.692,P＝2.684×10-4)。 其比值比(odds ratio,OR)為0.68[95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)：0.50～0.95](表5)。其余2種單體型YAGDA(0.1187 vs 0.0684,t＝7.801,P＝3.671×10-3)和YATDG(0.0827 vs 0.0275,t＝9.463,P＝1.197×10-5)的頻率顯著高于對照組。其OR分別為1.72(95%CI：1.28～2.46)和 2.87(95%CI：1.87～4.90)(表 5)。

表5 IgAN患者和正常對照者的單體型

3 討論

IgAN被認(rèn)為是一種多基因和多因素疾病[6-7]。廣泛的證據(jù)表明遺傳因素參與了IgAN的易感性和進(jìn)展[8-9]?；诩易逍訧gAN數(shù)據(jù)的連鎖分析顯示,家族性IgAN可以在顯性模型具有不完全的外顯率[10]。然而,在這些關(guān)聯(lián)的區(qū)間內(nèi)沒有鑒定出IgAN的候選基因。因此,散發(fā)性IgAN患者的SNP分析將有助于鑒定可能最初牽連于該多基因疾病的其他基因。在過去的20年中,許多研究進(jìn)行了遺傳關(guān)聯(lián)研究,他們發(fā)現(xiàn)許多候選基因與IgAN的易感性和進(jìn)展有關(guān),這些基因大多集中于IgAN的進(jìn)展而不是IgAN的發(fā)病[11-12]。另一方面,大多數(shù)關(guān)于IgAN的關(guān)聯(lián)性研究是在相對較少的病例對照人群內(nèi)進(jìn)行的,并用單一SNP進(jìn)行分析[13]?？赡軐?dǎo)致大多數(shù)IgAN遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究缺乏可重復(fù)性。在進(jìn)行基于人群的遺傳關(guān)聯(lián)研究時,大樣本(超過1 000人)的分析趨向于產(chǎn)生更多的可復(fù)制關(guān)聯(lián),而不是小樣本[14]。否則,htSNPs選擇和單體型分析的最新發(fā)展提供了更多強(qiáng)大的遺傳關(guān)聯(lián)研究?；谏鲜隹紤],本研究設(shè)計(jì)了基于單體型分析的新疆地區(qū)維吾爾族IgAN患者和地理民族匹配的健康對照的大樣本人群中的遺傳關(guān)聯(lián)研究。結(jié)果表明,C1GALT1基因的變異,尤其是單體型 YATIG、YAGDA、YATDG與IgAN易感性有關(guān)。

本研究首先篩選了一個亞樣品中C1GALT1和C1GALT1C1基因的多態(tài)性,并分別檢測到9個SNP和1個SNP。然后選擇C1GALT1基因內(nèi)的5個htSNP進(jìn)行進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析。IgAN患者-292C/D等位基因或DD基因型頻率顯著高于對照組。單倍型YATIG頻率明顯低于對照組,而單倍型YAGDA或YATDG頻率明顯高于對照組。這些結(jié)果表明C1GALT1基因的變異會影響IgAN的易感性。正如我們在開始時提到的,核心1β3-Gal-T活性需要分子伴侶Cosmc的表達(dá)。然而,我們只在C1GALT1C1基因的編碼區(qū)內(nèi)檢測到1個SNP(T393A),其次要等位基因的頻率僅為0.069,它不能與進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析的標(biāo)準(zhǔn)相匹配。另一方面,盡管在天冬氨酸至谷氨酸(Asp131→Glu)的氨基酸取代中報(bào)道了SNP,T393A(rs17261572),但是在之前的研究中顯示正常的核心1β3-Gal-T活性[15]。這表明C1GALT1C1基因編碼區(qū)內(nèi)的變異對于IgA1的異常半乳糖基化不是必需的。

Pirulli等[16]研究發(fā)現(xiàn)C1GALT1基因的變異與意大利IgAN患者對IgAN的易感性相關(guān),確定了C1GALT1基因的1365G/G基因型,在健康對照者中啟動子CGATW單體型顯著較少。雖然1365G/A多態(tài)性與IgAN易感性之間的關(guān)系不能在較大的人群中復(fù)制,但本研究發(fā)現(xiàn)單倍型YATIG的頻率顯著降低,YAGDA和YATDG頻率顯著高于對照組。本研究結(jié)果表明,1365G/A多態(tài)性可能影響IgAN與C1GALT1基因中其他SNPs結(jié)合的易感性。在本研究中,我們鑒定了C1GALT1基因啟動子區(qū)域的7個SNPs；而在意大利人群中有2個SNPs[16]。這表明篩選不同人群特別是來自不同地域不同種族的人群的多態(tài)性是很重要的。除樣本量外,其他因素如種族差異,未知的環(huán)境因素以及IgAN的遺傳異質(zhì)性可能會帶來不同的結(jié)果。