張晶晶，肖紅劍，李育中，宮悅，畢研偉，寸韡

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

隨著衛(wèi)生條件的改善，花粉過敏、哮喘等過敏性疾病患者在發(fā)達(dá)國家逐年增加，甚至有研究者提出了“衛(wèi)生假說”，認(rèn)為衛(wèi)生條件越好兒童早期感染越少，后期患過敏的幾率越大?！靶l(wèi)生假說”目前仍存在爭議，而過敏性疾病的發(fā)病機(jī)理還有待深入研究。通常速發(fā)型過敏癥狀是由Ⅰ型超敏反應(yīng)引起的，過敏原第一次侵入機(jī)體可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IgE，IgE與靶細(xì)胞表面的高親和力受體（FcεRI）結(jié)合后，當(dāng)相同抗原再次侵入機(jī)體時(shí)，就可以引發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使靶細(xì)胞釋放組胺等生物活性物質(zhì)，引起過敏性炎癥反應(yīng)。FcεRI是四聚體結(jié)構(gòu)，由胞外α鏈、β鏈、γ-γ鏈組成[1]，在過敏反應(yīng)中與IgE結(jié)合的是其α亞基（FcεRIα）[2]。目前，研究Ⅰ型過敏反應(yīng)的小動(dòng)物模型主要是嚙齒類動(dòng)物，但是由于物種差異較大，很多研究結(jié)果與人體存在差異。近年來，樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正日益受到關(guān)注。作為靈長類動(dòng)物的近親，樹鼩在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、病毒感染特性及心理應(yīng)激模式等方面與靈長類甚至人類高度相似[3]。樹鼩全基因組測序分析結(jié)果顯示，其免疫系統(tǒng)與靈長類動(dòng)物的基因組具有較高的相似性[4-5]；同時(shí)，樹鼩的高親和力受體也存在α亞基，但對樹鼩FcεRIα的相關(guān)研究較少。為了更好地建立研究樹鼩過敏反應(yīng)的動(dòng)物模型，我們調(diào)取了樹鼩FcεRIα基因并表達(dá)該受體蛋白，免疫動(dòng)物制備抗體，為樹鼩過敏動(dòng)物模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)2～3周齡雄性樹鼩，體質(zhì)量130～180 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所國家樹鼩種質(zhì)資源中心；清潔級(jí)雌性新西蘭大白兔2～2.5 kg，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌DH5α、BL21，質(zhì)粒載體pET-30a（+）由本室保存。

限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NdeⅠ、XhoⅠ，T4DNA連接酶等購自NEB公司；TRIzol裂解液、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生工公司；TaqDNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技公司；質(zhì)粒大提試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及通用性DNA純化回收試劑盒購自北京天根技術(shù)公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigama公司；HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG購自Proteintech公司；轉(zhuǎn)染試劑jetPrime購自Polyplus公司。

1.2 樹鼩FcεR1α基因的調(diào)取

通過NCBI調(diào)取樹鼩相關(guān)基因（GenBank：XM_014584294.1）（1008 bp）為預(yù)測參考序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行巢式PCR，驗(yàn)證基因序列是否正確。Nuno?mura[6]等曾在小鼠肝臟中提取過IgE受體基因，因此本研究用TRIzol法快速提取RNA試劑盒提取樹鼩的脾臟和肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行巢式PCR。巢式引物設(shè)計(jì)如下：

Primer1-F：5′-TCTCTCCAGACCAGTCAGTACTTATTC-3′；Primer1-R：5′-TCCTGAGCACATATTTTTCTATGTACG-3′；Primer2-F：5′-CCAGTTTTGAACGCAGAGATCTC-3′；

Primer2-R：5′-GCAGTTGCTGATGCTAGAAATCGC-3′。

1.3 樹鼩IgE FcεR1α序列信號(hào)肽及跨膜區(qū)的預(yù)測及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

用SignalP 4.1信號(hào)肽預(yù)測軟件和TMHMM跨膜預(yù)測軟件預(yù)測人類和樹鼩的IgE FcεRIα的信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列。以pET-30a（+）為載體設(shè)計(jì)目的基因序列的引物，構(gòu)建pET-30a（+）/ts?FcεR1α和 pAAV-CMV-tsFcεR1α質(zhì)量。引物為Primer3-F（5′-GAACATATGGCCCTCCAGAAAACG GTC-3′；GAA為保護(hù)堿基，劃線部位為NdeI酶切位點(diǎn)）、Primer3-R（5′-GCAAAGCTTGGTATTCTTG CTGTGCTGAGC-3′；GCA為保護(hù)堿基，劃線部位為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。

1.4 樹鼩IgE FcεRIα的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂板培養(yǎng)，挑取單克隆，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.7時(shí)，用IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)，每隔1 h取樣，菌液超聲波破碎，通過SDS-PAGE找出最佳誘導(dǎo)時(shí)間。將誘導(dǎo)4 h的菌液離心，超聲波破碎，4℃、8000 r/min離心20 min，SDS-PAGE顯示蛋白主要表達(dá)在沉淀中，然后擴(kuò)大培養(yǎng)制備包涵體。

1.5 樹鼩IgE FcεRIα的純化

稱取包涵體，用6 mol/L鹽酸胍在37℃水浴中溶解包涵體約30 min，4℃、8000 r/min離心10 min，將溶解的包涵體樣品在冰上稀釋復(fù)性，并過夜放置復(fù)性，復(fù)性液用超濾器濃縮超濾，濃縮后的復(fù)性液通過AKTA explorer蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化（平衡柱子→上復(fù)性液→結(jié)合液平衡柱子→洗脫液洗脫目的蛋白），將洗脫的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.6 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的制備

將純化后的樹鼩IgE FcεRIα與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化混合后，于背部皮下多點(diǎn)第1次免疫新西蘭大白兔，所用蛋白量為400 μg；之后每隔2周分別進(jìn)行第2次和第3次免疫，將等體積的蛋白和不完全弗氏佐劑充分乳化混合后進(jìn)行免疫；第3次免疫后頸動(dòng)脈采血，分離血清。

1.7 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的特異性及效價(jià)檢測

1.7.1 Western印跡檢測 為了驗(yàn)證多克隆抗體的特異性，用制備的多克隆抗體鑒定pET-30a（+）/tsFcεR1α重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后的菌液，進(jìn)行West?ern印跡檢測。同時(shí)為了驗(yàn)證多克隆抗體是否能在真核細(xì)胞檢測到表達(dá)的樹鼩FcεR1α，用質(zhì)粒pAAV-CMV-tsFcεRIα轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過Western印跡檢測制備的多克隆抗體的生物學(xué)活性。

1.7.2 細(xì)胞免疫熒光檢測 293細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70% 左右，用質(zhì)粒pCW711（pAAV-CMV-tsFcεRIα）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后將細(xì)胞上清吸出，用4% 多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌；1% BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌；孵育一抗，按1∶2000室溫孵育30 min，PBS洗滌；孵育熒光二抗（Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG），按1∶2000室溫避光孵育30 min，PBS洗滌；滴加DAPI復(fù)染核并進(jìn)行封片，通過熒光顯微鏡觀察。

1.7.3 ELISA檢測多克隆抗體效價(jià) 將純化的蛋白稀釋至 2 μg/mL，每孔包被 100 μL，4℃過夜，1% BSA室溫封閉1 h，PBST洗滌1次，將兔血清分別稀釋至1/100、1/10 000、1/20 000、1/50 000、1/100 000、1/200 000、1/500 000，每孔孵育 100 μL，37℃孵育1 h，PBST洗滌；孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔（1∶5000）100 μL/孔，37℃孵育40 min；PBST洗板3次，滴加100 μL顯色液（TMB終濃度0.12 mg/mL，過氧化氫終濃度0.009% ），室溫避光顯色5～10 min，加入50 μL終止液（2 mol/L硫酸）終止反應(yīng)，于450 nm檢測吸收峰。

2 結(jié)果

2.1 克隆樹鼩IgE FcεRIα cDNA片段

以樹鼩的脾臟和肝臟為實(shí)驗(yàn)材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，巢式PCR（擴(kuò)增條件：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 10 s變性、56℃ 30 s退火、72℃ 30 s延伸，35個(gè)反應(yīng)循環(huán)；最后72℃延伸2 min）結(jié)果表明該基因在樹鼩脾臟中含量較高，因此后續(xù)試驗(yàn)采用樹鼩脾臟部位進(jìn)行。將PCR產(chǎn)物連接T載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果與樹鼩IgE FcεRIα序列比對基本一致。結(jié)果見圖1。

2.2 樹鼩IgE FcεR1α的信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測

NCBI公布的數(shù)據(jù)表明人類IgE FcεRIα的信號(hào)肽序列為1～25氨基酸殘基，跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)?03～225氨基酸殘基。用SignalP 4.1軟件預(yù)測的人類IgE FcεRIα信號(hào)肽序列也為1～25氨基酸殘基，用TMHMM跨膜軟件預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)?03～225氨基酸殘基；同時(shí)用SignalP 4.1和TMHMM軟件預(yù)測樹鼩IgE FcεRIα的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域序列，信號(hào)肽為1～25氨基酸殘基，胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)?～213氨基酸殘基，跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)?14～236氨基酸殘基。因此，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的序列為胞外結(jié)構(gòu)域去信號(hào)肽的第26～213氨基酸殘基，預(yù)測結(jié)果見圖2。

2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒

用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增編碼26～213氨基酸殘基的基因序列，目標(biāo)片段存在非特異性擴(kuò)增，經(jīng)切膠純化回收，用NdeⅠ、HindⅢ對目的片段和pET-30a（+）載體雙酶切，T4DNA連接酶16℃連接過夜，將構(gòu)建的質(zhì)粒用NdeⅠ、HindⅢ酶切，獲得569和5621 bp的片段，表明構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a（+）/tsFcεRIα。 將 pET-30a（+）/ts?FcεRIα及載體 pAAV-CMV 用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，T4DNA連接酶16℃連接過夜，將構(gòu)建的質(zhì)粒用BamHⅠ酶切，獲得1045和5026 bp片段，表明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)果見圖3。

2.4 樹鼩IgE FcεRIα重組蛋白的表達(dá)及純化

將構(gòu)建的質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與樹鼩該基因比對序列一致；構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂板，37℃振蕩培養(yǎng)，菌液D600nm為0.7時(shí)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別在1、2、3、4、5 h取樣，菌液超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)4 h后蛋白表達(dá)量沒有明顯增加，因此確定第4 h為蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間。將制備好的包涵體用6 mol/L鹽酸胍在37℃水浴中溶解約30 min，4℃、8000 r/min離心10 min，去掉部分沉淀，將溶解的包涵體樣品在冰上邊滴加邊攪拌稀釋復(fù)性，復(fù)性液為20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、1% 精氨酸、1 mmol/L還原型谷胱甘肽，過夜放置復(fù)性，將復(fù)性液過已經(jīng)處理好的Ni柱進(jìn)行親和層析純化，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE，蛋白純化率約90% 。結(jié)果見圖4。

2.5 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的制備及檢測

圖1 樹鼩總RNA提取及PCR擴(kuò)增

圖2 樹鼩和人IgE FCεR1α的信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

Western印跡（圖5A）表明，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液中未檢測到原核表達(dá)的IgE FcεR1α，而IPTG誘導(dǎo)后的菌液中能檢測到且條帶單一，證明制備的抗體特異性較好。在真核系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白存在翻譯后修飾，IgE FcεR1α比原核系統(tǒng)表達(dá)的偏大，且該抗體能檢測到真核細(xì)胞中表達(dá)的IgE FcεR1α，條帶單一，特異性較好（圖5B）。免疫熒光結(jié)果證明真核細(xì)胞中表達(dá)的該蛋白位于細(xì)胞膜表面，陰性對照未檢測到（圖5C）。ELISA檢測該抗體的效價(jià)可達(dá)到100 000（圖5D）。

3 討論

過敏性疾病是常見疾病，臨床癥狀多樣，包括過敏性哮喘、過敏性休克、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等。在過去的20年中過敏性疾病的發(fā)病率逐年上升，全世界有1.0～1.5億人患有哮喘，每年可導(dǎo)致約18萬人死亡。過敏性疾病是由Ⅰ型超敏反應(yīng)引起的，其主要中間物質(zhì)為IgE及其高親和力受體FcεRI，F(xiàn)cεRI主要分布于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中。IgE與FcεRIα具有較高的親和力（親和常數(shù)Ka≈10-10mol/L），二者結(jié)合可引起下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[7]。在小鼠哮喘模型中，IgE缺陷型或FcεRIα受體缺陷型接受塵螨提取物均未表現(xiàn)嚴(yán)重的氣道高炎癥反應(yīng)，相反，IgE和FcεRIα均獨(dú)立負(fù)責(zé)氣道高炎癥反應(yīng)[8-9]。因此，F(xiàn)cεRIα是參與Ⅰ型超敏反應(yīng)的關(guān)鍵分子。隨著分子免疫技術(shù)的發(fā)展，對抗體-受體相互作用的分子機(jī)制有了深入的了解，可以通過人工合成針對FcεRI特異性高、親和力強(qiáng)，但與其作用不產(chǎn)生生物學(xué)活性的抗體片段，從而對體內(nèi)的IgE產(chǎn)生競爭性抑制作用，達(dá)到治療目的[10-12]。李莉等[13]已制備出膜結(jié)合型抗大鼠FcεRIα的單克隆抗體，并證實(shí)其能競爭性抑制IgE與肥大細(xì)胞的結(jié)合。利用非過敏原性的抗IgE高親和力單克隆抗體與體內(nèi)游離的IgE結(jié)合形成的免疫復(fù)合物能夠中和IgE，抑制IgE合成，從而降低肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上IgE受體的表達(dá)[14-16]。IgE FcεRIα抗體還可作為檢測及篩選工具，通過流式細(xì)胞儀篩選肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等。目前，用于過敏反應(yīng)的動(dòng)物模型基本局限于小鼠，通過全基因組序列進(jìn)行生物進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)樹鼩比小鼠更接近人類，樹鼩與人類在基因方面具有遺傳關(guān)系[17]。目前，關(guān)于樹鼩的過敏反應(yīng)機(jī)制研究尚少。我們表達(dá)了樹鼩IgE FcεRIα蛋白，并制備出多克隆抗體，為今后研究樹鼩高親和力受體及建立樹鼩過敏反應(yīng)動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。

圖4 FCεR1α誘導(dǎo)表達(dá)與純化的SDS-PAGE

圖5 樹鼩IgE FCεR1α多克隆抗體的檢測