張晶晶，肖紅劍，李育中，宮悅，畢研偉，寸韡

中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明650118

隨著衛(wèi)生條件的改善，花粉過敏、哮喘等過敏性疾病患者在發(fā)達國家逐年增加，甚至有研究者提出了“衛(wèi)生假說”，認為衛(wèi)生條件越好兒童早期感染越少，后期患過敏的幾率越大?！靶l(wèi)生假說”目前仍存在爭議，而過敏性疾病的發(fā)病機理還有待深入研究。通常速發(fā)型過敏癥狀是由Ⅰ型超敏反應引起的，過敏原第一次侵入機體可以誘導B淋巴細胞產生抗原特異性IgE，IgE與靶細胞表面的高親和力受體（FcεRI）結合后，當相同抗原再次侵入機體時，就可以引發(fā)靶細胞內的一系列信號轉導，使靶細胞釋放組胺等生物活性物質，引起過敏性炎癥反應。FcεRI是四聚體結構，由胞外α鏈、β鏈、γ-γ鏈組成[1]，在過敏反應中與IgE結合的是其α亞基（FcεRIα）[2]。目前，研究Ⅰ型過敏反應的小動物模型主要是嚙齒類動物，但是由于物種差異較大，很多研究結果與人體存在差異。近年來，樹鼩作為一種新型實驗動物正日益受到關注。作為靈長類動物的近親，樹鼩在生理解剖、神經發(fā)育、病毒感染特性及心理應激模式等方面與靈長類甚至人類高度相似[3]。樹鼩全基因組測序分析結果顯示，其免疫系統與靈長類動物的基因組具有較高的相似性[4-5]；同時，樹鼩的高親和力受體也存在α亞基，但對樹鼩FcεRIα的相關研究較少。為了更好地建立研究樹鼩過敏反應的動物模型，我們調取了樹鼩FcεRIα基因并表達該受體蛋白，免疫動物制備抗體，為樹鼩過敏動物模型的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級2～3周齡雄性樹鼩，體質量130～180 g，購于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所國家樹鼩種質資源中心；清潔級雌性新西蘭大白兔2～2.5 kg，購于昆明醫(yī)科大學實驗動物中心；大腸桿菌DH5α、BL21，質粒載體pET-30a（+）由本室保存。

限制性內切酶HindⅢ、NdeⅠ、XhoⅠ，T4DNA連接酶等購自NEB公司；TRIzol裂解液、RT-PCR反轉錄試劑盒購自上海生工公司；TaqDNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技公司；質粒大提試劑盒、質粒小提試劑盒及通用性DNA純化回收試劑盒購自北京天根技術公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigama公司；HPR標記的羊抗兔IgG、Cy3標記的驢抗兔IgG購自Proteintech公司；轉染試劑jetPrime購自Polyplus公司。

1.2 樹鼩FcεR1α基因的調取

通過NCBI調取樹鼩相關基因（GenBank：XM_014584294.1）（1008 bp）為預測參考序列，設計引物進行巢式PCR，驗證基因序列是否正確。Nuno?mura[6]等曾在小鼠肝臟中提取過IgE受體基因，因此本研究用TRIzol法快速提取RNA試劑盒提取樹鼩的脾臟和肝臟RNA，逆轉錄成cDNA進行巢式PCR。巢式引物設計如下：

Primer1-F：5′-TCTCTCCAGACCAGTCAGTACTTATTC-3′；Primer1-R：5′-TCCTGAGCACATATTTTTCTATGTACG-3′；Primer2-F：5′-CCAGTTTTGAACGCAGAGATCTC-3′；

Primer2-R：5′-GCAGTTGCTGATGCTAGAAATCGC-3′。

1.3 樹鼩IgE FcεR1α序列信號肽及跨膜區(qū)的預測及表達質粒構建

用SignalP 4.1信號肽預測軟件和TMHMM跨膜預測軟件預測人類和樹鼩的IgE FcεRIα的信號肽和跨膜區(qū)序列。以pET-30a（+）為載體設計目的基因序列的引物，構建pET-30a（+）/ts?FcεR1α和 pAAV-CMV-tsFcεR1α質量。引物為Primer3-F（5′-GAACATATGGCCCTCCAGAAAACG GTC-3′；GAA為保護堿基，劃線部位為NdeI酶切位點）、Primer3-R（5′-GCAAAGCTTGGTATTCTTG CTGTGCTGAGC-3′；GCA為保護堿基，劃線部位為HindⅢ酶切位點）。

1.4 樹鼩IgE FcεRIα的誘導表達

將構建正確的質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），涂板培養(yǎng)，挑取單克隆，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.7時，用IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導表達，每隔1 h取樣，菌液超聲波破碎，通過SDS-PAGE找出最佳誘導時間。將誘導4 h的菌液離心，超聲波破碎，4℃、8000 r/min離心20 min，SDS-PAGE顯示蛋白主要表達在沉淀中，然后擴大培養(yǎng)制備包涵體。

1.5 樹鼩IgE FcεRIα的純化

稱取包涵體，用6 mol/L鹽酸胍在37℃水浴中溶解包涵體約30 min，4℃、8000 r/min離心10 min，將溶解的包涵體樣品在冰上稀釋復性，并過夜放置復性，復性液用超濾器濃縮超濾，濃縮后的復性液通過AKTA explorer蛋白純化系統進行純化（平衡柱子→上復性液→結合液平衡柱子→洗脫液洗脫目的蛋白），將洗脫的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測。

1.6 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的制備

將純化后的樹鼩IgE FcεRIα與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化混合后，于背部皮下多點第1次免疫新西蘭大白兔，所用蛋白量為400 μg；之后每隔2周分別進行第2次和第3次免疫，將等體積的蛋白和不完全弗氏佐劑充分乳化混合后進行免疫；第3次免疫后頸動脈采血，分離血清。

1.7 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的特異性及效價檢測

1.7.1 Western印跡檢測 為了驗證多克隆抗體的特異性，用制備的多克隆抗體鑒定pET-30a（+）/tsFcεR1α重組質粒誘導后的菌液，進行West?ern印跡檢測。同時為了驗證多克隆抗體是否能在真核細胞檢測到表達的樹鼩FcεR1α，用質粒pAAV-CMV-tsFcεRIα轉染293細胞，通過Western印跡檢測制備的多克隆抗體的生物學活性。

1.7.2 細胞免疫熒光檢測 293細胞接種至24孔板，待細胞密度達到70% 左右，用質粒pCW711（pAAV-CMV-tsFcεRIα）轉染細胞，48 h后將細胞上清吸出，用4% 多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌；1% BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌；孵育一抗，按1∶2000室溫孵育30 min，PBS洗滌；孵育熒光二抗（Cy3標記的驢抗兔IgG），按1∶2000室溫避光孵育30 min，PBS洗滌；滴加DAPI復染核并進行封片，通過熒光顯微鏡觀察。

1.7.3 ELISA檢測多克隆抗體效價 將純化的蛋白稀釋至 2 μg/mL，每孔包被 100 μL，4℃過夜，1% BSA室溫封閉1 h，PBST洗滌1次，將兔血清分別稀釋至1/100、1/10 000、1/20 000、1/50 000、1/100 000、1/200 000、1/500 000，每孔孵育 100 μL，37℃孵育1 h，PBST洗滌；孵育HRP標記的羊抗兔（1∶5000）100 μL/孔，37℃孵育40 min；PBST洗板3次，滴加100 μL顯色液（TMB終濃度0.12 mg/mL，過氧化氫終濃度0.009% ），室溫避光顯色5～10 min，加入50 μL終止液（2 mol/L硫酸）終止反應，于450 nm檢測吸收峰。

2 結果

2.1 克隆樹鼩IgE FcεRIα cDNA片段

以樹鼩的脾臟和肝臟為實驗材料提取RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，巢式PCR（擴增條件：95℃ 30 s預變性；95℃ 10 s變性、56℃ 30 s退火、72℃ 30 s延伸，35個反應循環(huán)；最后72℃延伸2 min）結果表明該基因在樹鼩脾臟中含量較高，因此后續(xù)試驗采用樹鼩脾臟部位進行。將PCR產物連接T載體進行測序，測序結果與樹鼩IgE FcεRIα序列比對基本一致。結果見圖1。

2.2 樹鼩IgE FcεR1α的信號肽及跨膜區(qū)預測

NCBI公布的數據表明人類IgE FcεRIα的信號肽序列為1～25氨基酸殘基，跨膜結構域為203～225氨基酸殘基。用SignalP 4.1軟件預測的人類IgE FcεRIα信號肽序列也為1～25氨基酸殘基，用TMHMM跨膜軟件預測的跨膜結構域為203～225氨基酸殘基；同時用SignalP 4.1和TMHMM軟件預測樹鼩IgE FcεRIα的信號肽及跨膜結構域序列，信號肽為1～25氨基酸殘基，胞外結構域為1～213氨基酸殘基，跨膜結構域為214～236氨基酸殘基。因此，本實驗擴增的序列為胞外結構域去信號肽的第26～213氨基酸殘基，預測結果見圖2。

2.3 構建重組表達質粒

用設計的引物擴增編碼26～213氨基酸殘基的基因序列，目標片段存在非特異性擴增，經切膠純化回收，用NdeⅠ、HindⅢ對目的片段和pET-30a（+）載體雙酶切，T4DNA連接酶16℃連接過夜，將構建的質粒用NdeⅠ、HindⅢ酶切，獲得569和5621 bp的片段，表明構建了原核重組表達質粒 pET-30a（+）/tsFcεRIα。 將 pET-30a（+）/ts?FcεRIα及載體 pAAV-CMV 用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，T4DNA連接酶16℃連接過夜，將構建的質粒用BamHⅠ酶切，獲得1045和5026 bp片段，表明真核表達質粒構建成功。結果見圖3。

2.4 樹鼩IgE FcεRIα重組蛋白的表達及純化

將構建的質粒測序，測序結果與樹鼩該基因比對序列一致；構建的質粒轉化大腸桿菌BL21，涂板，37℃振蕩培養(yǎng)，菌液D600nm為0.7時用IPTG誘導表達，分別在1、2、3、4、5 h取樣，菌液超聲波破碎后進行SDS-PAGE，結果顯示在誘導4 h后蛋白表達量沒有明顯增加，因此確定第4 h為蛋白最佳誘導時間。將制備好的包涵體用6 mol/L鹽酸胍在37℃水浴中溶解約30 min，4℃、8000 r/min離心10 min，去掉部分沉淀，將溶解的包涵體樣品在冰上邊滴加邊攪拌稀釋復性，復性液為20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、1% 精氨酸、1 mmol/L還原型谷胱甘肽，過夜放置復性，將復性液過已經處理好的Ni柱進行親和層析純化，洗脫液經SDS-PAGE，蛋白純化率約90% 。結果見圖4。

2.5 樹鼩IgE FcεRIα多克隆抗體的制備及檢測

圖1 樹鼩總RNA提取及PCR擴增

圖2 樹鼩和人IgE FCεR1α的信號肽及跨膜區(qū)預測

圖3 重組表達質粒的構建及鑒定

Western印跡（圖5A）表明，未經IPTG誘導的菌液中未檢測到原核表達的IgE FcεR1α，而IPTG誘導后的菌液中能檢測到且條帶單一，證明制備的抗體特異性較好。在真核系統中表達的蛋白存在翻譯后修飾，IgE FcεR1α比原核系統表達的偏大，且該抗體能檢測到真核細胞中表達的IgE FcεR1α，條帶單一，特異性較好（圖5B）。免疫熒光結果證明真核細胞中表達的該蛋白位于細胞膜表面，陰性對照未檢測到（圖5C）。ELISA檢測該抗體的效價可達到100 000（圖5D）。

3 討論

過敏性疾病是常見疾病，臨床癥狀多樣，包括過敏性哮喘、過敏性休克、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等。在過去的20年中過敏性疾病的發(fā)病率逐年上升，全世界有1.0～1.5億人患有哮喘，每年可導致約18萬人死亡。過敏性疾病是由Ⅰ型超敏反應引起的，其主要中間物質為IgE及其高親和力受體FcεRI，FcεRI主要分布于肥大細胞和嗜堿性粒細胞中。IgE與FcεRIα具有較高的親和力（親和常數Ka≈10-10mol/L），二者結合可引起下游級聯反應，從而引發(fā)炎癥反應[7]。在小鼠哮喘模型中，IgE缺陷型或FcεRIα受體缺陷型接受塵螨提取物均未表現嚴重的氣道高炎癥反應，相反，IgE和FcεRIα均獨立負責氣道高炎癥反應[8-9]。因此，FcεRIα是參與Ⅰ型超敏反應的關鍵分子。隨著分子免疫技術的發(fā)展，對抗體-受體相互作用的分子機制有了深入的了解，可以通過人工合成針對FcεRI特異性高、親和力強，但與其作用不產生生物學活性的抗體片段，從而對體內的IgE產生競爭性抑制作用，達到治療目的[10-12]。李莉等[13]已制備出膜結合型抗大鼠FcεRIα的單克隆抗體，并證實其能競爭性抑制IgE與肥大細胞的結合。利用非過敏原性的抗IgE高親和力單克隆抗體與體內游離的IgE結合形成的免疫復合物能夠中和IgE，抑制IgE合成，從而降低肥大細胞和嗜堿性粒細胞上IgE受體的表達[14-16]。IgE FcεRIα抗體還可作為檢測及篩選工具，通過流式細胞儀篩選肥大細胞和嗜堿性粒細胞等。目前，用于過敏反應的動物模型基本局限于小鼠，通過全基因組序列進行生物進化樹分析，發(fā)現樹鼩比小鼠更接近人類，樹鼩與人類在基因方面具有遺傳關系[17]。目前，關于樹鼩的過敏反應機制研究尚少。我們表達了樹鼩IgE FcεRIα蛋白，并制備出多克隆抗體，為今后研究樹鼩高親和力受體及建立樹鼩過敏反應動物模型奠定了基礎。

圖4 FCεR1α誘導表達與純化的SDS-PAGE

圖5 樹鼩IgE FCεR1α多克隆抗體的檢測