劉寧，孫鶴鳴，趙怡雯，馬雪萍，陳健康，魏從文，鐘輝，楊曉莉

1.武警總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100039；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710032；3.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）是一類結(jié)構(gòu)、功能與生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡。TGF-β有6種亞型，其中TGF-β1亞型的活性最強(qiáng)，發(fā)揮主要的生物學(xué)功能[1]。迄今發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少表達(dá)3種TGF-β（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）的配體，TGF-β1亞型在人體肝臟中的表達(dá)最豐富，并且參與調(diào)控多種慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

肝臟纖維化是各種慢性肝病的病理基礎(chǔ)，而TGF-β1能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellatecells，HSCs）異?；罨?，使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular ma?trix，ECM）過(guò)度沉積，加快成肌纖維細(xì)胞的纖維化病變[2-3]。在肝纖維化患者及CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)都升高[4]；TGF-β是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT）的重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGF-β1刺激肝癌細(xì)胞時(shí)，低表達(dá)Smad7或過(guò)表達(dá)Smad3/4的細(xì)胞EMT增強(qiáng)[5]；在肝癌患者中TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)EMT使癌細(xì)胞獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解ECM的能力，促進(jìn)肝癌的不良預(yù)后發(fā)展[6]。

高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，位于高爾基體中。在正常肝臟中GP73少量表達(dá)并維持肝臟正常生理功能，而在各種肝臟疾病中表達(dá)增高，如病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌等[7-8]。研究認(rèn)為，GP73作為診斷早期肝癌的血清標(biāo)志物有較高的臨床價(jià)值，此外GP73水平還與肝癌組織的分化程度密切相關(guān)[9]。Zhang等認(rèn)為在腫瘤免疫微環(huán)境中γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）能夠誘導(dǎo)GP73表達(dá)上調(diào)[10]；GP73還能通過(guò)調(diào)控EGFR/RTK、TGF-β1/Smad2等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。然而，腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中GP73表達(dá)升高和調(diào)控的機(jī)制尚不完全清楚。在肝細(xì)胞癌中，GP73與TGF-β信號(hào)通路均是腫瘤進(jìn)程中的重要靶分子與信號(hào)通路，GP73高表達(dá)提示我們考慮是否TGF-β能夠調(diào)控GP73的表達(dá)。然而，GP73與TGF-β信號(hào)通路之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們的結(jié)果表明TGF-β能激活GP7啟動(dòng)子，上調(diào)GP73 mRNA和蛋白水平。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pcDNA3-Flag-GP73為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；GP73抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；胎牛血清、α-tubulin抗體購(gòu)自Sigma公司；兔抗山羊IgG/辣根過(guò)氧化物酶、羊抗小鼠IgG/辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自北京中杉金橋公司；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME購(gòu)自Polypluse公司；TRIzol-A+總RNA提取試劑、2×TS Reaction mix、gDNA Remover、TransS?cript RT/RI Enzyme mix、Anchored Oligo（dT）18Primer、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）購(gòu)自Tiangen公司；hGP73引物（Forward：5′-TGGCCTGC ATCATCGTCTTG-3′；Reverse：5′-CCCTGGAACTCGT TCTTCTCA-3′）由奧科生物技術(shù)服務(wù)公司合成；Daul-Luciferase Reporter Assay試劑盒購(gòu)自Pramega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10% 胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。以60 mm的培養(yǎng)皿為例，新傳代的HepG2生長(zhǎng)到60% ～80% 時(shí)給細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基2 mL。

準(zhǔn)備2支EP管，各加入200 μL jetPRIME Buffer，分別加入Flag-GP73質(zhì)粒、Flag-V質(zhì)粒各2 μg，漩渦振蕩 15 s，再各加入 jetPRIME Reac?tion Reagent 8 μL，渦旋混勻 15 s，靜置 10 min后將配好的轉(zhuǎn)染工作液加入細(xì)胞培養(yǎng)基，4 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊至4 mL，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞進(jìn)行下一步操作。

1.3 免疫印跡

根據(jù)收取的細(xì)胞數(shù)量加入適量的4×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)蛋白marker的電泳情況判斷目的蛋白的跑膠位置，待目的蛋白分離開(kāi)后即可轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜條件：18 V，1.5 h）；用含5% 脫脂奶粉的1×TBST室溫?fù)u床孵育1 h封閉PVDF膜，封閉后用1×TBST洗膜3～5 min，重復(fù)3次，室溫孵育一抗1 h或4℃孵育過(guò)夜，用1×TBST洗膜，重復(fù)3次，每次5 min；加入酶標(biāo)二抗，室溫?fù)u床孵育 1 h，用 1×TBST洗膜 5 min，重復(fù) 3次；用Western Lighting Plus ECL試劑顯影。

1.4 細(xì)胞總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR

棄去培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次，棄去PBS，直接在平皿內(nèi)加入1 mL TRIzol-A+裂解細(xì)胞，用加樣槍吹打幾次并將細(xì)胞懸液移至無(wú)RNA酶的離心管內(nèi)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)靜置5 min使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；加200 μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min后4℃、12 000 r/min離心10 min，樣品會(huì)分成不同顏色的3層，RNA主要存在于無(wú)色水相層；將約500 μL水相用加樣槍移至新的無(wú)RNA酶離心管中，加入等體積的異丙醇，漩渦振蕩混勻，室溫放置30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清留取管側(cè)和管底的白色膠狀沉淀；用無(wú)RNA酶的ddH2O配制的75% 乙醇1 mL洗滌沉淀，輕柔吹打混勻，4℃、5000 r/min離心3 min，棄去上清，室溫放置3 min；根據(jù)管底白色膠狀沉淀的量加入適宜量的DEPC水，反復(fù)混勻，充分溶解RNA沉淀；取1 μL用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，記錄并保存?zhèn)溆谩?/p>

以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系包括 2 μg 總 RNA、1 μL Anchored Oligo（dT）18Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransS?criptRT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover，用無(wú)RNA酶的水補(bǔ)齊反應(yīng)體系至20 μL，42℃孵育30 min，85℃孵育5 min。

最后進(jìn)行熒光定量PCR，以2 μL cDNA為模板，加入 10 μL TransStart Top Green qPCR Su?perMix（2×），hGP73的上、下游引物各0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系至20 μL。擴(kuò)增條件：94℃孵育5 s，56℃孵育15 min，72℃ 10 min。

1.5 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞傳至12孔培養(yǎng)板中，用TGF-β按實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用適量的1×PBS輕柔洗滌細(xì)胞，避免細(xì)胞脫落，盡可能將漂洗培養(yǎng)板的PBS吸出；每孔加入200 μL 1×裂解緩沖液（PLB），于搖床上室溫裂解15 min，得到細(xì)胞裂解液，用于檢測(cè)螢光素酶；取30 μL細(xì)胞裂解液加入EP管中，再加入30 μL螢光素酶檢測(cè)試劑（LAR），混勻后用熒光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)光值，然后加入測(cè)定作為內(nèi)參的海腎螢光素酶的30 μL反應(yīng)終止液，并測(cè)得其發(fā)光值，二者的比值為螢光素酶的相對(duì)活性（relative luciferase activity，RLA）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用Graphpad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β在蛋白水平影響GP73的表達(dá)

用2 ng/mL TGF-β1刺激分別轉(zhuǎn)染了Flag-V、Flag-GP73質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，在不同時(shí)間（0、1、2、4、8 h）點(diǎn)收取細(xì)胞并裂解，制樣進(jìn)行 West?ern印跡，檢測(cè)在TGF-β1的刺激下細(xì)胞內(nèi)GP73的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在處理1 h后，不論是否轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)GP73的質(zhì)粒，GP73蛋白的表達(dá)水平都顯著升高，F(xiàn)lag-V對(duì)照組4 h達(dá)到高峰并持續(xù)到8 h，而過(guò)表達(dá)GP73組2 h達(dá)到峰值，4或8 h后有所下降（圖1A）。下一步又檢測(cè)了不同濃度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1刺激轉(zhuǎn)染了Flag-V、Flag-GP73質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，處理時(shí)間8 h，Western印跡結(jié)果顯示GP73的表達(dá)對(duì)TGF-β1處理的濃度有劑量依賴性（圖1B）。結(jié)果提示，GP73的表達(dá)水平受到TGF-β1刺激的影響，表現(xiàn)為時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

圖1 TGF-β在蛋白質(zhì)水平影響GP73的表達(dá)

2.2 TGF-β在mRNA水平影響GP73的表達(dá)

既然TGF-β能影響GP73蛋白的表達(dá)，我們猜測(cè)TGF-β是否影響GP73 mRNA水平的表達(dá)。用2 ng/mL TGF-β1刺激HepG2細(xì)胞不同的時(shí)間（0、1、2、4、8 h），或用不同濃度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1處理HepG2細(xì)胞8 h，收取各處理?xiàng)l件的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR，比較不同處理?xiàng)l件的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞GP73 mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，GP73 mRNA在TGF-β1處理1 h后表達(dá)升高，4 h時(shí)達(dá)峰值，之后開(kāi)始下降（圖2A）；在0～2 ng/mL TGF-β1濃度范圍內(nèi)，GP73 mRNA表達(dá)水平隨TGF-β1刺激濃度的升高而升高（圖2B）。

圖2 TGF-β在mRNA水平影響GP73的表達(dá)

2.3 TGF-β1能直接激活GP73啟動(dòng)子

TGF-β能在mRNA水平影響GP73的轉(zhuǎn)錄，那么TGF-β作為轉(zhuǎn)錄因子是否能與GP73啟動(dòng)子序列結(jié)合，從而影響GP73的轉(zhuǎn)錄水平？通過(guò)分析GP73基因的上游DNA序列，在距離啟動(dòng)子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄起始位-1005～-998核苷酸處）有一個(gè)Smad結(jié)合元件（SBE，序列為CAGACA）。分別構(gòu)建包含GP73啟動(dòng)子、GP73啟動(dòng)子突變體序列的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，SEB突變體序列為CACACA（圖3A）。在HepG2細(xì)胞內(nèi)分別轉(zhuǎn)染這2種質(zhì)粒，利用雙螢光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)TGF-β1是否能夠直接激活GP73啟動(dòng)子。結(jié)果表明，TGF-β1刺激能夠激活GP73啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增高達(dá)6倍多，而當(dāng)GP73啟動(dòng)子突變后，轉(zhuǎn)錄活性并沒(méi)有升高（圖3B）。

圖3 TGF-β1能直接激活GP73啟動(dòng)子

3 討論

在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，TGF-β發(fā)揮雙向調(diào)控作用。在肝癌早期，TGF-β主要通過(guò)Smad信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞增殖周期蛋白依賴性激酶CDKs抑制因子P15、P21的表達(dá)，使細(xì)胞的生長(zhǎng)周期停滯，發(fā)揮抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[13]；而在肝癌進(jìn)展期，TGF-β可以降低IL-2的分泌，抑制抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞作用，繼而免疫T細(xì)胞的活化、增殖及B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子受到抑制而不能發(fā)揮正常的免疫殺傷功能，有助于腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，加快腫瘤進(jìn)展[14-15]；另一方面，TGF-β能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的分泌，加快腫瘤血管的生成，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分泌ECM而加速肝臟細(xì)胞的纖維化進(jìn)程[16]。據(jù)報(bào)道，肝癌組織中GP73顯著升高，使細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白減少，波形蛋白增多，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，與肝癌的不良預(yù)后息息相關(guān)[17]；肝細(xì)胞癌患者血清中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均顯著升高，TGF-β 1在肝癌組織中的表達(dá)水平、腫瘤大小與有無(wú)血管侵襲均有關(guān)[18]。而腫瘤組織中GP73蛋白表達(dá)升高的分子機(jī)制尚不可知，因此，我們推測(cè)TGF-β信號(hào)通路可能與GP73水平具有密切關(guān)系。

本研究中，我們從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平探討了TGF-β對(duì)GP73表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明TGF-β能與GP73啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)GP73的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)GP73蛋白的表達(dá)。因此我們有理由認(rèn)為，肝癌組織中GP73蛋白的異常表達(dá)至少部分受TGF-β的調(diào)控，而GP73是否能夠調(diào)控TGF-β信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。