胡桂萍，曹紅妹，石旭平，楊帆，施龍清，杜賢明，王軍文，鄧真華，王禮獻(xiàn)，江新鳳

1.江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌 330202；2.閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué) 應(yīng)用生態(tài)研究所，福建 福州 350002；3.江西省蠶桑工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330202

［關(guān)鍵字］ 不動(dòng)桿菌；吡蟲啉降解菌；重金屬離子；降解動(dòng)力學(xué)

吡蟲啉是茶葉生產(chǎn)中有效防治茶蚜、假眼小綠葉蟬、茶黃薊馬等害蟲的重要?dú)⑾x劑。噴灑到茶園的吡蟲啉，大約95% 通過(guò)蒸騰、揮發(fā)、滲透等方式進(jìn)入茶葉植株和茶園土壤等環(huán)境中，有效利用在害蟲上的比例很低。另外茶葉具有自身特殊性，茶葉以采葉為主，單位質(zhì)量表面積大，噴藥部位是直接采收，且一年多次采摘，加上農(nóng)藥間隔期短，茶葉上吡蟲啉等農(nóng)藥殘留量大[1]，同時(shí)吡蟲啉在茶葉和茶園土的半衰期分別為5.5[2]和10～150 d[3]，因此，茶葉和茶園土壤吡蟲啉超標(biāo)問(wèn)題頻繁出現(xiàn)，也是制約我國(guó)茶葉出口的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

我們通過(guò)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)并優(yōu)選到多株對(duì)吡蟲啉等農(nóng)藥有強(qiáng)降解作用的微生物，其中不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）BCL-1在實(shí)驗(yàn)室條件下，24 h內(nèi)對(duì)100 mg/g吡蟲啉的降解率可達(dá)84%[4]。但是降解菌在室外受多種因子協(xié)同作用，不僅包括污染物的濃度，還有多類型污染源疊加阻遏，如重金屬絡(luò)合物的生物效應(yīng)，以及生物因子影響，如環(huán)境微生物群落影響等。由于茶樹(shù)根系長(zhǎng)期富鋁，根系土壤周圍酸化程度高，土壤鹽基離子淋溶活性增強(qiáng)[5]。加之茶園系統(tǒng)中物質(zhì)與能量循環(huán)均受自然與人為活性的雙重影響形成開(kāi)放系統(tǒng)，系統(tǒng)中銅、鉛、鎘等離子的累積量又高[6]，其中紅壤發(fā)育的土壤中銅含量最高[7]，而銅離子為茶園土壤重金屬污染的重要元素[8]。研究表明，土壤中農(nóng)藥殘留與土壤重金屬污染是協(xié)同正相關(guān)，而重金屬離子對(duì)土壤酶活性和微生物酶活力的作用常常呈現(xiàn)正相關(guān)[9-10]。

為了實(shí)現(xiàn)吡蟲啉降解菌BCL-1在茶園環(huán)境等室外大田的高效利用，需要對(duì)其環(huán)境因子影響機(jī)理進(jìn)行預(yù)判，尤其是對(duì)茶園土壤中重金屬離子的影響進(jìn)行深入探討，為后續(xù)降解菌生物反應(yīng)器的研制提供參考。江西省茶區(qū)是重要的紅壤區(qū)，土壤酸化嚴(yán)重，銅和鎘等重金屬含量超標(biāo)[11-12]。在此，我們主要探討菌株BCL-1的吡蟲啉降解特性，并重點(diǎn)分析鋁離子和銅離子影響下的降解菌BCL-1的降解動(dòng)力學(xué)和半衰期等參數(shù)，為進(jìn)一步研制適宜江西紅壤茶區(qū)茶葉吡蟲啉降污劑提供支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

不動(dòng)桿菌BCL-1分離自茶葉圍環(huán)境，保存于江西省蠶桑茶葉研究所微生物菌種保藏中心。

吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（99.8% ）購(gòu)自國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心；氯化鈉、硝酸銨、硫酸鎂、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、酵母提取物、二氯甲烷、鹽酸、甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）均為國(guó)產(chǎn)試劑。

液相分析儀（安捷倫1260）；其他設(shè)備包括高壓鍋、超凈臺(tái)、紫外分光光度儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、pH酸堿計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲波儀、低溫高速離心機(jī)等。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖5.0 g，加蒸餾水定容到1 L，pH7.2。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NaCl 1.0 g，NH4NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，pH7.0，以吡蟲啉作為碳源，濃度視需要添加。

1.2 BCL-1降解吡蟲啉動(dòng)力學(xué)研究

將培養(yǎng)好的BCL-1菌懸液，按10% 的比例接種到含100 mg/L吡蟲啉的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中（pH8.0），30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，對(duì)培養(yǎng)液中的吡蟲啉濃度進(jìn)行0、1、2、3、4、5、6、7 d取樣檢測(cè)，檢測(cè)菌液的D600nm值及吡蟲啉質(zhì)量濃度，研究菌株BCL-1在不同吡蟲啉初始濃度下的生長(zhǎng)量及降解率，并計(jì)算動(dòng)力學(xué)方程和半衰期。試驗(yàn)設(shè)置不接種菌懸液和不含菌體培養(yǎng)基分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 重金屬離子對(duì)BCL-1降解吡蟲啉的影響

配置濃度為50 mg/kg的銅離子和鋁離子母液，然后按比例添加到100 mg/L無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，分別制備成 10、50、100、200、500 mg/kg銅離子和 10、50、100、500、1000 mg/kg鋁離子濃度的培養(yǎng)基。將新鮮培養(yǎng)的菌體BCL-1細(xì)胞按5% 的接種量接種至上述培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，24 h后開(kāi)始取樣，每隔24 h取樣測(cè)定培養(yǎng)液中的吡蟲啉濃度，計(jì)算降解菌降解率和降解半衰期，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，以接種滅活的BCL-1為對(duì)照。

1.4 吡蟲啉濃度檢測(cè)和分析方法

1.4.1 吡蟲啉的提取 取10 mL培養(yǎng)液于50 mL帶磨口塞的三角瓶中，加入10 mL二氯甲烷和10 mL鹽酸（pH3），蓋上瓶塞，超聲波提取5 min，吸取下層于新的錐形瓶中，上層清液再加入5 mL二氯甲烷超聲波提取2 min，取下層與第一次下層有機(jī)相合并，轉(zhuǎn)入干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，調(diào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度至40℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干之后，向瓶中加入2 mL色譜級(jí)甲醇，旋轉(zhuǎn)搖蕩使瓶壁上的殘留農(nóng)藥盡量溶解，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，收集溶液于GC小瓶中，高效液相色譜分析菌株對(duì)吡蟲啉的降解率。

1.4.2 吡蟲啉的高效液相色譜檢測(cè) 安捷倫1260液相色譜儀，UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。色譜柱為 Symmetry C18（0.5 μm×4.5 min×250 mm），流動(dòng)相為水∶甲醇（20∶80），流速1 mL/min，柱溫保持室溫，運(yùn)行10 min，吡蟲啉保留時(shí)間為3.85 min，進(jìn)樣量10 μL，采用外標(biāo)法定量測(cè)定。

1.4.3 菌液D600nm值的測(cè)定 菌液D600nm值為測(cè)定值與空白對(duì)照值的差值（以未接種菌液的選擇性培養(yǎng)基D600nm值作為空白對(duì)照值）。

1.5 動(dòng)力學(xué)方程

BCL-1降解吡蟲啉的過(guò)程用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程描述，半衰期計(jì)算公式如下：

對(duì)式兩邊同時(shí)取自然對(duì)數(shù)：

式中，Ct為t時(shí)刻培養(yǎng)基中農(nóng)藥的殘留濃度（mg/L）；Co為吡蟲啉的初始濃度（mg/L）；k為降解速率常數(shù)（d-1）；t為降解時(shí)間（d）。

半衰期（t1/2）為農(nóng)藥降解50% 所需時(shí)間（d）：

2 結(jié)果

2.1 不動(dòng)桿菌BCL-1的生長(zhǎng)特性及其對(duì)吡蟲啉的降解特性

不動(dòng)桿菌BCL-1在吡蟲啉基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1，符合一元二次回歸方程。接種后第4 d菌株生長(zhǎng)量達(dá)到最高，第5 d后迅速下降。但BCL-1對(duì)吡蟲啉降解菌的降解率（圖2）呈線性上升趨勢(shì)，第5 d的降解率僅為57.5% ，而第6 d和第7 d更高，分別達(dá)到65.7% 和87.9% 。這主要與菌株代謝物生產(chǎn)量和代謝物中的水解酶、氧化還原酶的生成有關(guān)，菌株在第5 d雖然生物量最高，但代謝物累積量未達(dá)到最高，因此，第6 d和第7 d的吡蟲啉降解率更高。

圖1 吡蟲啉降解菌BCL-1的生長(zhǎng)曲線

2.2 不動(dòng)桿菌BCL-1降解吡蟲啉的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和半衰期

通過(guò)對(duì)不動(dòng)桿菌BCL-1降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析并計(jì)算半衰期得到（圖3），BCL-1降解吡蟲啉的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式為y=55.175e-0.271x，半衰期為2.56 d，顯著低于已報(bào)道的茶葉和茶園土中吡蟲啉的半衰期，郭冬梅報(bào)道的吡蟲啉在江西紅壤中的半衰期是12.9 d[2]，這為BCL-1在茶產(chǎn)業(yè)吡蟲啉降污中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了前景。

2.3 重金屬離子對(duì)BCL-1降解吡蟲啉的影響

菌株BCL-1在添加不同濃度Cu2+的吡蟲啉基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的降解特性見(jiàn)圖4。各濃度Cu2+處理下BCL-1對(duì)吡蟲啉的降解率均與空白對(duì)照的變化趨勢(shì)一致，無(wú)差異，均呈現(xiàn)前5 d快速上升達(dá)到最高和第6 d緩慢降低的趨勢(shì)。第5 d，10、50、100、200、500 mg/kg Cu2+作用下的降解率分別為59.84% 、62.49% 、62.96% 、66.26% 、64.84% ，空白對(duì)照的降解率為57.52% 。

圖2 菌株BCL-1的吡蟲啉降解特性

圖3 菌株BCL-1降解吡蟲啉的動(dòng)力學(xué)模型

往100 mg/L的吡蟲啉基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加10、50、100、500、1000 mg/kg的 Al3+后，動(dòng)態(tài)測(cè)定菌株BCL-1對(duì)吡蟲啉的降解率，結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照相比，添加10、50、100 mg/kg的Al3+后，吡蟲啉降解菌同期均比對(duì)照高，且與Al3+濃度呈負(fù)相關(guān)。添加10 mg/kg Al3+的降解率同期最高，第5 d達(dá)最高為79.51% ，而對(duì)照第5 d也達(dá)最高，但降解率僅為57.19% ；次之為50 mg/kg Al3+,降解率第5 d為75.56% ，其次為100 mg/kg Al3+，第5 d的降解率為73.97% 。但500和1000 mg/kg Al3+處理后吡蟲啉降解率同期均低于對(duì)照，5 d后的降解率分別為34.14% 和36.18% ?？梢钥闯?，不同濃度Al3+對(duì)吡蟲啉降解率有影響，低于100 mg/kg的Al3+可以提高BCL-1對(duì)吡蟲啉的降解能力，而在高于500 mg/kg Al3+的環(huán)境中，BCL-1對(duì)吡蟲啉的降解能力受到抑制。

2.4 不同重金屬離子對(duì)菌株BCL-1降解吡蟲啉的動(dòng)力學(xué)和半衰期的影響

分析不同濃度Cu2+和Al3+對(duì)菌株BCL-1降解吡蟲啉的動(dòng)力學(xué)和半衰期的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。5種濃度 Cu2+（10、50、100、200、500 mg/kg）處理下的半衰期分別為2.16、2.06、2.14、2.08、2.12 d，與空白對(duì)照的半衰期2.26 d相比無(wú)差異，表明Cu2+對(duì)BCL-1的降解作用無(wú)影響。而不同濃度Al3+作用下BCL-1的降解動(dòng)力學(xué)和半衰期差異很大，其中10、50、100 mg/kg Al3+處理下的半衰期分別為1.52、1.56、1.75 d，明顯低于空白對(duì)照的 2.26 d，而500和1000 mg/kg Al3+處理下的半衰期分別為3.67和3.52 d。從半衰期可以看出，Cu2+不影響菌株BCL-1降解吡蟲啉的特性，而低濃度的Al3+對(duì)BCL-1降解吡蟲啉有促進(jìn)作用，高濃度的Al3+會(huì)抑制BCL-1降解吡蟲啉的能力。

圖4 不同濃度Cu2+對(duì)菌株BCL-1降解吡蟲啉的影響

圖5 不同濃度Al3+對(duì)菌株BCL-1降解吡蟲啉的影響

表1 不同濃度Cu2+和Al3+作用下BCL-1降解吡蟲啉的動(dòng)力學(xué)方程和半衰期

3 討論

一般而言，強(qiáng)降解效能的菌株具有農(nóng)藥強(qiáng)耐受性和高適應(yīng)性特性，能以農(nóng)藥作為重要營(yíng)養(yǎng)源。本研究中的吡蟲啉降解菌BCL-1在100 mg/L吡蟲啉無(wú)機(jī)鹽中生長(zhǎng)旺盛，在第5 d可以達(dá)到生長(zhǎng)高峰，而降解能力一直持續(xù)上升直到第7 d，這與BCL-1在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的分泌物中含有大量降解酶有關(guān)。不同的金屬離子對(duì)不同菌株降解農(nóng)藥的作用方式不同，即使是同一種金屬離子，對(duì)同一菌株降解不同農(nóng)藥作用的影響也是有差異的[13-14]。金屬離子對(duì)菌株降解甲胺磷農(nóng)藥有不同程度的促進(jìn)或抑制作用，Cu2+可以促進(jìn)菌株HK1降解甲胺磷[15]。同一金屬離子對(duì)不同菌株降解甲胺磷產(chǎn)生不同的促進(jìn)或抑制作用，說(shuō)明不同菌株產(chǎn)生的降解酶系不同。Cu2+抑制嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌1對(duì)阿特拉津的降解[16]。但本研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Cu2+對(duì)菌株BCL-1降解吡蟲啉無(wú)影響，半衰期與對(duì)照相比也無(wú)明顯差異，而低于100 mg/L的Al3+可以促進(jìn)吡蟲啉的降解，高于200 mg/kg的Al3+會(huì)強(qiáng)烈抑制吡蟲啉的降解，說(shuō)明BCL-1菌株及其酶系作用不受Cu2+的影響，但是與環(huán)境的酸堿度影響。茶園根系呼吸作用會(huì)分泌大量蘋果酸、檸檬酸、草酸等有機(jī)酸和多酚類物質(zhì)，對(duì)鋁具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力，促進(jìn)了固定態(tài)鋁的活化，活化的鋁可以吸附羥基或與氫離子交換，高濃度Al3+增進(jìn)土壤酸化[5]。從這點(diǎn)可以看出，BCL-1及其吡蟲啉降解酶系不耐強(qiáng)酸，但不受Cu2+的影響。

茶園土壤是一個(gè)多體系復(fù)合體，還有大量其他金屬離子，如鎘離子、汞離子等也是茶園重金屬污染的重要元素，這些重金屬離子的絡(luò)合作用對(duì)于降解菌有一定的影響[17]，對(duì)降解酶有影響[18]，進(jìn)而影響降解菌的室外投放效能。本研究探討了Al3+和Cu2+對(duì)BCL-1降解吡蟲啉的影響，還需對(duì)其他影響因素及機(jī)制進(jìn)行多維度分析，才能全面客觀地明晰BCL-1降解環(huán)境毒物的機(jī)制，為BCL-1降污劑產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。