李素芬，王唯斯，自加吉，陳瑩，戴莉萍，余敏，熊偉

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理州人民醫(yī)院 病理科，云南 大理 671000；3.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 530061

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（mitochondrial transcrip?tion termination factors，MTERFs）是一類由核基因編碼且定位于線粒體，具有MTERF結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，廣泛存在于后生動物和植物中[1-3]。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2（MTERF2）又稱線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域3（mitochondrial transcription termination factor domain-containing 3，MTERFD3），是MTERF蛋白家族成員[4]。Mterf2基因是在比較血清饑餓與血清培養(yǎng)的人類成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異時發(fā)現(xiàn)的一個細(xì)胞增殖抑制基因[5]。檢索NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，小鼠Mterf2基因定位于10C1，含有4個外顯子。Mterf2mRNA的開放讀框（ORF）為1158 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由385個氨基酸殘基組成。目前，關(guān)于小鼠Mterf2基因在動物體內(nèi)組織中的表達(dá)尚未見研究報道。在本研究中，我們通過RT-PCR克隆小鼠Mterf2基因的cDNA序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Mterf2基因系統(tǒng)發(fā)生樹，采用Northern印跡和qRT-PCR方法檢測Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠各組織中的表達(dá)，Western印跡檢測MTERF2蛋白在小鼠各組織中的表達(dá)。本研究探索了Mterf2基因在BALB/c小鼠不同組織中的表達(dá)規(guī)律，為進一步研究Mterf2基因在動物體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、組織RNA保存液、焦碳酸二乙酯（DEPC）購自北京天根生物科技有限公司；pMD19-T克隆載體、RNAiso Plus提取試劑盒、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ 和BamHⅠ、T4DNA連接酶購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司；瓊脂糖、Trans 2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR染料SYBR Premix ExTaq購自南京諾唯贊生物科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA組織細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE配膠試劑盒、4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二辛可寧酸（BCA）法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)mega公司；增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自Millipore公司；兔抗MTERFD3單克隆抗體（ab230128）、兔抗 GAPDH單克隆抗體（ab181602）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab6721）購自Abcam公司；分析純級異丙醇、無水乙醇和75% 乙醇購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；PCR引物和cDNA探針由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 實驗動物及處理

健康清潔級BALB/c小鼠8只，雄性，40 d齡，平均每只體重30.0±4.1 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號碼為SCXK（滇）2016-0002。

處死小鼠前禁食12 h，僅供飲水。頸椎脫臼處死動物，取心、腦、脾、肺、腎、肝、胰腺、肌肉和睪丸等9種組織，每樣組織標(biāo)本約100 mg，分別放入含500 μL RNA保存液的1.5 mL EP管中備用。組織樣本采集均于處死動物后30 min內(nèi)完成，所用解剖工具和EP管均用0.1% DEPC水浸泡過夜后高溫高壓消毒[6]。

1.3 小鼠各組織總RNA提取和cDNA合成

選用BALB/c小鼠的9種不同組織，各取100 mg組織樣本在無RNase的碾磨器中勻漿后用RNA提取試劑盒RNAiso Plus提取各組織的總RNA，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性，用Nanodrop One UV/Vis微量核酸蛋白定量儀測定各樣品的總RNA濃度，每個樣本重復(fù)測量3次，取平均值。在經(jīng)DEPC處理的0.2 mL離心管中加入小鼠各組織的總RNA 4 μL，分別加入1 μL Random Primer（100 μmol/L）和 1 μL Oligo（dT）18（100 μmol/L），用無RNase的ddH2O將體系補足至12 μL，混合均勻后短暫離心，65℃孵育5 min，迅速置于冰上，向反應(yīng)體系中加入5×MMuLV 緩沖液4μL、dNTPs（10 μmol/L）2 μL、RNase抑制劑（5 U/μL）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/μL）1 μL，使反應(yīng)總體積為 20 μL，混合均勻后短暫離心，于42℃溫育60 min，75℃ 5 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后將制備的cDNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠Mterf2基因cDNA編碼區(qū)的克隆及序列分析

PCR擴增引物參照GenBank公布的Mterf2mRNA序列（NM_172135.2），采用Oligo 7.56軟件設(shè)計。Mterf2基因cDNA編碼區(qū)序列（CDS）上游擴增引物為 5′-ATGCCGTGGAGGTTGCCGA-3′，下游擴增引物為 5′-TCACTCTTCAACCTTTAATG-3′。以BALB/c小鼠肝組織cDNA為模板進行PCR擴增（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃延伸 5 min），用柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收擴增產(chǎn)物中的目的片段，與pMD19-T克隆載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，擴大培養(yǎng)細(xì)菌，菌液PCR鑒定后，提取陽性克隆質(zhì)粒并進行酶切鑒定[7]。將陽性克隆的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用Lasergene 7.0軟件進行序列分析及同源性比對。

1.5 小鼠Mterf2基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載智人（Homo sa?piens，NM_025198.4）、黑猩猩（Pan troglodytes，XM_009426159.2）、大 鼠（Rattusnorvegicus，NM_001014265.2）、牛（Bos taurus，NM_001191174.1）、馬（Equuscaballus，XM_023631006.1）、非 洲 爪 蛙（Xenopus tropicalis，XM_002942200.4）、斑馬魚（Danio rerio，NM_001044828.2）等7個物種的Mterf2基因同源cDNA序列，用MEGA 6.0軟件分析，鄰接法構(gòu)建小鼠Mterf2基因的系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 Northern印跡檢測小鼠不同組織中Mterf2 mRNA的表達(dá)差異

利用抽提的BALB/c小鼠各組織總RNA，采用Sambrook等的方法進行Northern轉(zhuǎn)膜和雜交[8]。將20 μg總RNA在1.5% 變性瓊脂糖凝膠上電泳分開，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以α-［32P］dCTP標(biāo)記的Mterf2cDNA片段為探針進行分子雜交（雜交條件為68℃，16 h），用1×SSC、0.2% SDS于68℃洗 15 min，再用 0.5×SSC、0.1% SDS于 68℃洗 15 min，將洗好的膜置于80℃烘干后壓X線膠片曝光。同樣方法，以β-actincDNA為探針再次進行Northern印跡，作為內(nèi)參對照。

1.7 實時熒光定量PCR檢測小鼠不同組織中Mterf2 mRNA的表達(dá)量

采用 SYBR GreenⅠ染料法，以小鼠GAPDH為內(nèi)參基因，目的基因、內(nèi)參基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，ddH2O為陰性對照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量，在Roche Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增和數(shù)據(jù)分析。實時熒光定量RT-PCR引物見表1。實時熒光定量PCR體系（20.0 μL）包括2×SYBR Premix ExTaq10.0 μL，Primer-F（10 μmol/L）、Primer-R（10 μmol/L）各 0.5 μL，模板 3.0 μL，用 ddH2O 補足至 20.0 μL。PCR 程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。

1.8 Western印跡檢測小鼠不同組織中MTERF2蛋白表達(dá)量

取小鼠各組織標(biāo)本100 mg，分別加入1 mLRIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑），提取總蛋白，4℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中，采用BCA法測定提取的蛋白質(zhì)濃度。取各組織的總蛋白樣品30 μg與4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，煮沸10 min；將已處理的蛋白質(zhì)樣品進行12% 的SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用Trans-Blot Turbo蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印儀20 V電壓轉(zhuǎn)膜7 min，50 g/L脫脂牛奶封閉2 h；加入用封閉液1∶1000稀釋的兔抗MTERFD3單抗，兔抗GAPDH單抗，4℃孵育過夜；TBS-T洗滌PVDF膜10 min，換液，重復(fù)3次；加入用封閉液1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；TBS-T洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。用Chemi?Doc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并拍照，用系統(tǒng)配置的Image Lab 5.2.1軟件計算蛋白質(zhì)條帶的灰度值，以MTERF2/GAPDH的灰度值比值表示MTERF2蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

表1 實時熒光定量RT-PCR的引物

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用GraphPad Prism 5.01軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩樣本均值間的比較采用t檢驗，多樣本均值間采用One-way ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Mterf2基因cDNA編碼區(qū)序列的RTPCR擴增

以BALB/c小鼠肝組織總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，Mterf2基因cDNA CDS擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果見圖1，RT-PCR擴增片段約為1158 bp，與預(yù)期一致。

圖1 BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA編碼區(qū)序列的克隆

2.2 重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定

對轉(zhuǎn)化有pMD19-T-Mterf2的大腸桿菌進行菌液PCR擴增電泳檢測，提取重組質(zhì)粒用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，菌液PCR產(chǎn)物位置與陽性對照結(jié)果一致，大小與預(yù)期片段相符（圖2）；重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物大小分別與目的基因片段及pMD19-T載體大小相符（圖3）。

圖2 菌液PCR結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果

2.3 小鼠Mterf2基因系統(tǒng)發(fā)生分析

將陽性克隆含有的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進行DNA測序，結(jié)果顯示BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA編碼區(qū)序列全長1158 bp，編碼385個氨基酸殘基，與GenBank參考序列（NM_028832.3）的同源性達(dá)100% ，無任何堿基突變和移碼突變。用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Mterf2基因系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，小鼠Mterf2基因與大鼠Mterf2基因序列的同源性最高，達(dá)到91.0% ，說明兩者進化關(guān)系最近，聚類為一簇（圖4），其次與人、黑猩猩、牛和馬聚類為一簇，最后與非洲爪蛙聚類。小鼠Mterf2基因與人Mterf2基因的同源性為80.3% ，進化關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

圖4 鄰接法構(gòu)建不同物種Mterf2基因的核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹

2.4 Nothern印跡檢測小鼠各組織中Mterf2基因mRNA表達(dá)差異

Nothern印跡檢測結(jié)果見圖5，小鼠Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同組織中均有不同程度的表達(dá)，尤其是在新陳代謝旺盛的組織，如大腦、心、肝、腎等組織中表達(dá)程度較高，但在肺和脾中的表達(dá)程度較低。

圖5 Nothern印跡檢測Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同組織中的表達(dá)

2.5 小鼠Mterf2基因mRNA的組織表達(dá)譜分析

分別以BALB/c小鼠不同組織的cDNA為模板，用qRT-PCR檢測GAPDH和Mterf2基因的表達(dá)情況。樣品曲線均在循環(huán)結(jié)束前進入平臺期。Mterf2和GAPDH基因的擴增曲線和熔解曲線均達(dá)到實驗要求（圖6A、B）。qRT-PCR結(jié)果顯示，Mterf2基因在BALB/c小鼠大腦、心臟、肝臟和腎臟中的表達(dá)量較高，其次是睪丸、胰腺和肌肉組織，而在肺臟和脾臟組織中的表達(dá)量相對較低。以大腦組織中Mterf2基因mRNA表達(dá)量為對照組，用Graphpad Prism 5.01軟件對熒光定量結(jié)果求平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，作柱狀圖（圖6C）。

2.6 小鼠MTERF2蛋白的組織表達(dá)譜分析

Western印跡檢測BALB/c小鼠MTERF2蛋白在各組織中的表達(dá)，結(jié)果見圖7，MTERF2蛋白在小鼠大腦、心、肝和腎組織中的表達(dá)量較高，其次是睪丸、胰腺和肌肉組織，而在肺和脾組織中的表達(dá)量相對較低。以大腦組織中MTERF2蛋白表達(dá)量為對照組，Western印跡定量結(jié)果與熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果基本一致。

3 討論

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族各成員參與線粒體基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控[9]。MTERF蛋白家族成員有2個顯著特征，即定位于線粒體和存在不定重復(fù)數(shù)的MTERF結(jié)構(gòu)域[10]。人Mterf2基因是2003年Chen等在比較血清培養(yǎng)細(xì)胞及血清饑餓細(xì)胞的基因表達(dá)差異時首次被克隆。人MTERF2與MTERF1蛋白的氨基酸序列有52% 的同源性，并具有MTERF家族共有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[5]。MTERF2能夠抑制線粒體基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，對細(xì)胞的生長及增殖具有負(fù)調(diào)控作用[11-12]。過表達(dá)Mterf2基因?qū)⒓?xì)胞的增殖阻滯于G1和S期之間[13]。研究表明，MTERF2不僅是一個非序列特異性的線粒體DNA（mtDNA）結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且是參與線粒體類核的組成的重要蛋白質(zhì)[14]。MTERF2在哺乳動物mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中并非必要的轉(zhuǎn)錄因子，但卻是生理應(yīng)激響應(yīng)時調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[14]。

圖6 qRT-PCR檢測Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同組織中的相對表達(dá)量

圖7 Western印跡檢測MTERF2蛋白在BALB/c小鼠不同組織中的相對表達(dá)量

2006年，Luca等首次克隆和鑒定了小鼠Mterf2基因,并通過免疫熒光技術(shù)證實MTERF2蛋白定位于線粒體，是一個典型的核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)[15]。BALB/c小鼠是目前常用的實驗動物，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生理學(xué)等研究，Mterf2基因在BALB/c小鼠中的組織表達(dá)譜尚不清楚。本研究首次從BALB/c小鼠中克隆到小鼠Mterf2基因cDNA的編碼區(qū)序列，并檢測到Mterf2基因在BALB/c小鼠各組織中的表達(dá)程度不同，通過Northern印跡、熒光定量RT-PCR和Western印跡等方法對Mterf2基因的表達(dá)量進行了分析。結(jié)果表明，Mterf2基因在BALB/c小鼠大腦、心臟、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)量較高，其次是胰腺、睪丸和肌肉組織，而在肺臟和脾臟組織中的表達(dá)量相對較低。張林冰等檢測MTERFs蛋白在C57BL小黑鼠腦、肝和腎組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的表達(dá)水平最高，高于肝組織和腎組織；MTERF2蛋白在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中的表達(dá)高于人心肌細(xì)胞HCM[16]。Han等也發(fā)現(xiàn)，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中，MTERF2蛋白能促進1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)引起的線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷[17]。我們的研究結(jié)果表明，Mterf2基因在BALB/c小鼠體內(nèi)的表達(dá)具有組織特異性，在線粒體含量豐富且代謝旺盛的組織中高表達(dá)。值得注意的是，不同的遺傳背景可能會導(dǎo)致Mterf2基因表達(dá)譜的改變，在利用BALB/c小鼠作為研究人類疾病的動物模型時，應(yīng)加以考慮[18]。

總之，本研究為探索Mterf2基因在實驗動物體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，同時，我們推測Mterf2基因在各組織中的表達(dá)情況可能與小鼠品系、營養(yǎng)水平及飼養(yǎng)環(huán)境等影響因素有關(guān)，這有待于進一步研究。