牛銀萍 ，郭淼 ，付朝陽 ，王喆

(1、南陽市第二人民醫(yī)院兒科，河南 南陽473000；2、南陽市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 南陽 473000)

新生兒呼吸窘迫綜合征 （neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是臨床上較為常見的呼吸系統(tǒng)疾病，流行病學(xué)研究顯示，NRDS的發(fā)病率可達(dá)233～455/1萬人左右，在孕周介于28～32周之間時(shí)，NRDS的發(fā)病率可進(jìn)一步上升[1]。

表面活性物質(zhì)蛋白C（surfactant protein C，SPC）的功能狀態(tài)或者表達(dá)缺失是影響到NRDS發(fā)生的重要因素，蛋白水平的修飾或者空間結(jié)構(gòu)的改變，能夠通過影響到SP-C的合成量及生理功能，促進(jìn)NRDS的發(fā)生[2]。SP-C基因exonⅡ結(jié)構(gòu)基因突變能夠通過影響到SP-C的表觀遺傳學(xué)的改變，影響到肺泡表面凝脂的分泌，降低了SP-C前體成分的卷曲、末端修飾及磷酸化等過程，增加了肺泡擴(kuò)張過程中肺泡表面張力，促進(jìn)了肺泡的萎縮[3，4]。部分研究揭示了SP-C蛋白的表達(dá)異常對(duì)于NRDS的發(fā)生的影響，認(rèn)為SP-C的表達(dá)下降是促進(jìn)NRDS發(fā)生的重要因素[5]，但對(duì)于基因水平的改變研究不足。為了進(jìn)一步探討SP-C基因exonⅡ結(jié)構(gòu)基因突變與新生兒呼吸窘迫綜合征的關(guān)系，本研究選取2014年2月至2017年12月在我院治療的NRDS患兒110例，探討了exonⅡ基因突變與NRDS臨床特征的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2017年12月在我院治療的NRDS患兒110例（NRDS組），納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《實(shí)用新生兒學(xué)》第4版中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴有嚴(yán)重先天性疾病、遺傳代謝性疾病、嚴(yán)重窒息等；⑵母親孕后期有明確感染史；⑶孕期糖尿病、胎膜早破。同時(shí)選取新生兒病房住院未發(fā)生NRDS患兒110例作為對(duì)照組，兩組患兒性別、胎齡、出生體重及母親年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2 試劑和方法 離心機(jī)minix-6k購自上海精密儀器有限公司，Applied Biosystems ABI 2720購自美國墨塞飛公司，熒光PCR試劑盒Real-Time PCR Reagents&Kits購自美國墨塞飛公司。

1.3 檢測(cè)方法 采集患者抗凝血5ml（2.5%枸椽酸鈉溶液抗凝），按照10000r/min的離心速度進(jìn)行離心分離血清，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，加0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)30s，室溫 3min，12000×g，4℃離心 15min 得到 RNA。加等體積異丙醇，-20℃，30min，棄上清，加75%乙醇 1ml，振蕩，20μl DEPC 水，室溫放置 5min 使其完全溶解。加入逆轉(zhuǎn)錄酶5ul，室溫下放置20min后植入37℃水浴鍋中孵育30min，在底物中加入上游引物0.5uM、下游引物0.5uM，RT-PCR反應(yīng)混合液 5ul，dNTP 稀釋至 20ul， 反應(yīng)條件：95℃3min、95℃15s、90℃5s，一共 40 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增長度為134bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP-C基因exonⅡ基因突變篩查 SP-C基因exonⅡ基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，第115位基因位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)雜合突變c.115G＞T，為錯(cuò)義突變，基因型為G/T（突變型），c.115G＞T突變基因測(cè)序序列見圖1。

圖1 SP-C基因exonⅡ的測(cè)序圖

2.2 兩組SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突變分析 NRDS組G/T基因型比例為8.18%，明顯高于對(duì)照組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突變基因型比較

2.3 SP-C基因 exonⅡ c.115G＞T基因突變與NRDS臨床特征關(guān)系 G/T患兒胸片Ⅲ～Ⅳ級(jí)比例和病死率分別為100.00%和66.67%，明顯高于GG型患兒（P＜0.05）；G/T 和 GG 型患兒性別、胎齡、出生體重、使用機(jī)械通氣比例和PS使用3～4劑比例差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突變與NRDS臨床特征關(guān)系

3 討論

在孕周小于28周的早產(chǎn)兒中，NRDS的發(fā)病率可達(dá)65%以上，而在孕周介于28~37周的早產(chǎn)兒中，NRDS的發(fā)病率可達(dá) 1.5%~15%左右[6]。NRDS的病情進(jìn)展，可以導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后的惡化，流行病學(xué)研究顯示，NRDS的臨床總體治療效果仍然較為局限，糖皮質(zhì)激素等治療后的病情緩解率不足35%，孕周小于34周的早產(chǎn)兒NRDS治療后病死率仍然可達(dá)27%以上[7]。NRDS的發(fā)生呈現(xiàn)出了一定的區(qū)域性差異，提示基因水平的改變可能是影響到NRDS發(fā)生的重要因素[8]。基因的改變能夠通過影響肺泡表面活性物質(zhì)的合成，導(dǎo)致磷脂成分比例的下降，降低了磷脂單分子層的穩(wěn)定性[9，10]。通過揭示NRDS患者表觀遺傳學(xué)或者基因水平改變的結(jié)局，能夠?yàn)楹罄m(xù)臨床上NRDS的治療、預(yù)后評(píng)估或者隨訪等提供參考指標(biāo)。

SP-C基因exonⅡ是SP-C上游轉(zhuǎn)錄末端的最后一個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄活性的改變能夠提高SP-C的合成速度，并穩(wěn)定磷脂及蛋白的比例，提高其對(duì)于磷脂細(xì)菌表面多糖成分的抵御能力。部分研究認(rèn)為，SP-C基因exonⅡ能夠提高SP-C蛋白在肺泡表面的擴(kuò)散能力，降低局部氧化應(yīng)激障礙等導(dǎo)致的肺泡張力的增加[11]。另外，在敲除了SP-C基因exonⅡ基因的小鼠中，可以發(fā)現(xiàn)顯著的早產(chǎn)子代NRDS的發(fā)生或者成熟子代肺不張及肺功能衰竭的發(fā)生[12]。在人群對(duì)照試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)的是，SPC基因exonⅡ基因的異常表達(dá)在部分研究中有少量報(bào)道，認(rèn)為SP-C基因exonⅡ的基因點(diǎn)突變或者錯(cuò)義突變是促進(jìn)患者SP-C發(fā)生的重要因素，但缺乏SP-C基因exonⅡ點(diǎn)突變與患兒臨床結(jié)局的關(guān)系研究。

可以發(fā)現(xiàn)的是，第115位基因位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)雜合突變c.115G＞T，為點(diǎn)突變，G/T位點(diǎn)的點(diǎn)突變能夠影響到下游SP-C基因的翻譯及轉(zhuǎn)錄活性，影響到SP-C蛋白的生物學(xué)功能，同時(shí)在病例組中G/T類型的表型的比例更高，提示G/T位置的點(diǎn)突變或者表型的改變均可能顯著參與到了NRDS的發(fā)病過程中，從機(jī)制上考慮G/T位點(diǎn)的點(diǎn)突變或者基因型的改變對(duì)于NRDS發(fā)生的影響，考慮可能與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)[13]：⑴exonⅡc.115G＞T基因突變導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程的異常，影響到了SP-C蛋白的合成速度；⑵exonⅡc.115G＞T基因突變的發(fā)生，能夠通過影響到G/T表型的變化，促進(jìn)患者體內(nèi)肺泡表面活性物質(zhì)的末端磷酸化修飾過程的障礙，導(dǎo)致SP蛋白特別是SP-C蛋白生物學(xué)活性的下降。有研究者[14，15]在探討了NRDS患者的體內(nèi)基因表觀遺傳學(xué)的改變后發(fā)現(xiàn)，exonⅡ c.115G＞T基因突變可以增加5%左右的NRDS的發(fā)生率，同時(shí)相應(yīng)位置點(diǎn)突變的發(fā)生能夠?qū)е禄颊撷蛐蜕掀ぜ?xì)胞功能的代償障礙，降低肺泡表面薄膜的穩(wěn)定性。G/T患兒胸片Ⅲ～Ⅳ級(jí)比例和病死率明顯高于GG型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同的exonⅡc.115位置表型的改變能夠顯著影響到NRDS患兒的臨床預(yù)后，增加惡性臨床結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這主要考慮與GT基因型的改變能夠促進(jìn)下游體內(nèi)SP-C蛋白的錯(cuò)誤折疊及四級(jí)空間結(jié)構(gòu)的形成，并能夠通過影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡運(yùn)輸體的ATP能量利用障礙，導(dǎo)致患者SP-C蛋白的合成后運(yùn)輸過程異常，肺泡表面活性物質(zhì)含量及生物學(xué)活性明顯下降，肺部實(shí)質(zhì)性病變明顯增強(qiáng)，而病死率也明顯增加。但并未發(fā)現(xiàn)胎齡、出生體重、使用機(jī)械通氣比例等與exonⅡc.115的關(guān)系，提示exonⅡc.115可能主要影響到NRDS的遠(yuǎn)期生存預(yù)后。

綜上所述，SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突變可能與NRDS的發(fā)生具有一定的關(guān)系，并與患者的病死率等臨床特征相關(guān)。