張曉梅 ，夏小明 ，羅興燕 ，胡旺 ，黃鵬 ，3

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，江西 南昌 330006；2、江西省上饒市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 上饒 334000；3、江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330006)

結(jié)核病是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，來自202 個(gè)國家和地區(qū)的數(shù)據(jù)顯示，2013年有大約900萬人罹患結(jié)核病，150萬人死于該疾病[1]。傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片靈敏度僅有20%～30%，分枝桿菌培養(yǎng)是目前臨床上應(yīng)用于結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其需等4～6周時(shí)間才能有結(jié)果，培養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)陽性率偏低，陽性率只有30%～40%[2]。近年新發(fā)展起來的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) （Tuberculous infectin of T cells spot test，T-SPOT.TB) 屬于以 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的檢測方法，具有敏感性和特異性均較高的特點(diǎn)[3，4]，已在國內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用?？菇Y(jié)核桿菌抗體（TB-Ab）屬于以體液免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的免疫學(xué)診斷方法[5]，該方法簡便快速，結(jié)果易于判斷，但是TB-Ab試驗(yàn)影響因素較多，其敏感性和特異性均較低[6]。鑒于此，本研究擬采用T-SPOT.TB和TB-Ab兩種試驗(yàn)聯(lián)合對疑似結(jié)核病患者進(jìn)行檢測以探討其診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年7月-2017年5月在我院住院治療的疑似結(jié)核病患者257例，按照患者各自最后確診情況，分為結(jié)核性疾病組和非結(jié)核性疾病組。

1.1.1 結(jié)核性疾病組 共142例，其中男84例，女56 例，年齡 18～90 歲，平均年齡（50.12±19.47）歲。該組有肺結(jié)核88例，結(jié)核性胸膜炎32例，陳舊性支氣管結(jié)核4例，腰椎結(jié)核5例，腸結(jié)核3例，腎結(jié)核3例，骨結(jié)核2例，附睪結(jié)核2例，結(jié)核性腦膜炎1例，結(jié)核性淋巴結(jié)炎1例，結(jié)核變態(tài)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎1例。該組所有結(jié)核病病例的診斷均符合國家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的 《結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn) （WS196-2001）》和《肺結(jié)核診斷（ws288-2008）》的標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 非結(jié)核性疾病組 共115例，其中男64例，女 49 例，年齡 18～86 歲，平均年齡（57.91±18.02）歲。該組有肺部感染23例，感染性發(fā)熱17例，肺部陰影9例，慢阻肺8例，支氣管擴(kuò)張8例，胸腔積液7例，肺部腫瘤5例，自身免疫性疾病4例，其他病例34例。

1.2 研究方法

1.2.1 T-SPOT.TB的測定及結(jié)果判斷 采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)檢測，試劑盒是上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供 （英國牛津原裝進(jìn)口）。實(shí)驗(yàn)步驟：①采集4-6ml肝素抗凝血樣本，用ficoll試劑密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞 （PBMs），將提取的PBMs用AIM-V培養(yǎng)液配置成規(guī)定密度的細(xì)胞懸液。②取4個(gè)測試孔分別加入陽性試劑，結(jié)核特異性抗原 A（ESAT-6）和抗原 B（CFP-10），空白孔（AIM-V培養(yǎng)液）。將配置好的PBMs細(xì)胞懸液分別加入4個(gè)測試孔。③將測試孔放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20h。④培養(yǎng)好的測試孔加酶標(biāo)二抗在2～8℃孵育1h后洗滌，加顯色劑使得測試孔顯色產(chǎn)生斑點(diǎn)。⑤在顯微鏡下根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)判斷結(jié)果：空白孔＜5時(shí)，A孔或B孔減空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6以及空白孔≥6時(shí)，A孔或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔，結(jié)果判讀為陽性；如上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性孔正常時(shí)則結(jié)果判讀為陰性。

1.2.2 TB-Ab的測定及結(jié)果判斷 采用斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾技術(shù)（DIGFA）檢測，試劑盒由上海奧普生物醫(yī)藥有限公生產(chǎn)。操作嚴(yán)格按試劑盒說明書操作；結(jié)核桿菌IgG抗體檢測的結(jié)果判斷是：在反應(yīng)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)均出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)判為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的陽性率及其比較 結(jié)核性疾病組的T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的陽性率分別為88.7%，60.6%，非結(jié)核性疾病組T-SPOT.TB，TB-Ab的陽性率分別為20.9，23.5%，兩組比較陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均有 P＜0.01）。結(jié)果見表 1。

2.2 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種檢測方法的單用和聯(lián)用的診斷效果 T-SPOT.TB單用靈敏度88.7%、特異度79.1%、陽性預(yù)測值84.0%、陰性預(yù)測值85.0%、陽性似然比4.240、陰性似然比0.143、診斷符合率84.4%；TB-Ab單用靈敏度60.6%、特異度76.5%、陽性預(yù)測值76.1%、陰性預(yù)測值61.1%、陽性似然比2.518、陰性似然比0.515、診斷符合率67.7%；兩種方法并聯(lián)靈敏度95.8、特異度62.6%、陽性預(yù)測值76.0%、陰性預(yù)測值92.3%、陽性似然比2.561、陰性似然比0.067、診斷符合率80.9%；兩種方法串聯(lián)靈敏度53.5%、特異度93.9%、陽性預(yù)測值91.6%、陰性預(yù)測值62.1%、陽性似然比8.77、陰性似然比0.495、診斷符合率71.6%。結(jié)果見表2。

表1 兩組T-SPOT.TB和TB-Ab檢測的陽性率及其比較[n（%）]

表2 T-SPOT.TB和TB-Ab兩種方法單用及聯(lián)合檢測的診斷指標(biāo)比較

3 討論

快速準(zhǔn)確診斷和早期治療是結(jié)核病防治的有效措施。傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法均存在一定的缺陷，結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）易受卡介苗和機(jī)體免疫力的影響，其特異度、靈敏度較低。作為結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或抗酸染色雖然特異度高但靈敏度低，而且細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)很長，給結(jié)核病的快速診斷帶來困難。近年來T-SPOT.TB試驗(yàn)被廣泛用于臨床結(jié)核病的診斷。T-SPOT.TB以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的檢測方法，感染結(jié)核后體內(nèi)長期存在抗原特異性T細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素（IFN-γ）。 實(shí)驗(yàn)中利用分泌靶抗原 6（ESAT-6）和培養(yǎng)分泌蛋白10（CFP 10）兩種結(jié)核特異性抗原刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素，結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(即ELISPOT技術(shù))，通過檢測受結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應(yīng)T細(xì)胞來判斷受試者是否存在結(jié)核感染[7，8]。本研究中TSPOT.TB檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比分別為88.7%、79.1%、84.0%、85.0%、4.24、0.143， 與 Han-Yan Xu等研究的基本接近[9]，但低于國內(nèi)文獻(xiàn)吳桂玲等的報(bào)道（陰性似然比除外）[10]，可能與研究的病例來源或數(shù)量有關(guān)。TB-Ab的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷符合率分別為60.6%、76.5%、76.1%、61.1%、67.7%，與杜巖青等的研究基本一致[11]。

本研究顯示，T-SPOT.TB檢測的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于TB-Ab，提示T-SPOT.TB試驗(yàn)診斷價(jià)值高于TB-Ab試驗(yàn)。其原因?yàn)镋SAT-6和CFP-l0均來自結(jié)核分枝桿菌基因組RDl區(qū)域，且僅有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群存在RDl區(qū)，所有的卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌均缺失該區(qū)域，因此T-SPOT.TB方法不受卡介苗接種、環(huán)境分枝桿菌感染的影響，具有靈敏度高、特異度強(qiáng)等特點(diǎn)[7，12]。而TB-Ab檢測結(jié)果影響因素較多，如交叉抗原、免疫復(fù)合物、接種卡介苗或曾感染過結(jié)核但未發(fā)生臨床反應(yīng)或已鈣化等均可影響檢測結(jié)果，靈敏度、特異度低于TSPOT.TB方法[13]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，堪薩斯分枝桿菌、蘇氏分枝桿菌、海分枝桿菌等環(huán)境分枝桿菌中存在ESAT-6和CFP-l0抗原，可導(dǎo)致T-SPOT.TB試驗(yàn)產(chǎn)生假陽性[9]；本研究中115例非結(jié)核病人有24例假陽性，可能與環(huán)境分枝桿菌或患者存在潛伏感染有關(guān)。

多種診斷方法的聯(lián)合使用可提高診斷的價(jià)值。本研究中T-SPOT.TB和TB-Ab并聯(lián)的靈敏度為95.8%，均高于T-SPOT.TB和TB-Ab單用的靈敏度，排除結(jié)核病的能力提高，但特異度降低（62.6%），該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14，15]。 本研究T-SPOT.TB和TB-Ab串聯(lián)試驗(yàn)的特異度為93.9%，確診結(jié)核病的能力提高，但靈敏度降低（53.5%），與 Han-Yan Xu 等報(bào)道的結(jié)果類似[9]，低于Zhang L等的研究[16]。原因可能是Zhang L等的研究采用的是外周血和漿膜腔積液兩種不同標(biāo)本的T-SPOT.TB的聯(lián)合檢測，兩種試驗(yàn)的靈敏度都很高，致使串聯(lián)的靈敏度也較高。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測的各項(xiàng)診斷指標(biāo)均優(yōu)于TB-Ab試驗(yàn)，兩種試驗(yàn)聯(lián)合檢測可以互相彌補(bǔ)不足。在具體工作中，可以根據(jù)實(shí)際需要選擇并聯(lián)或串聯(lián)，以達(dá)到提高排除疾病或確診疾病能力的目標(biāo)。