聞芳 ，姚芳苡 ，黃自坤 ，彭亦平 ，傅穎媛

(1、南昌大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，江西 南昌 330006；2、江西省血液中心檢驗科，江西 南昌 330052；3、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；4、江西省胸科醫(yī)院內(nèi)二科，江西 南昌 330006)

結核病是嚴重危害人類健康的感染性疾病。我國結核病患者人數(shù)居全球第三位，被WHO列為全球22個結核病高負擔國家之一[1]。結核病的早期診斷及治療對結核的防治有至關重要的意義。環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是新近發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA，其呈環(huán)狀而得名[2，3]。近年研究表明環(huán)狀RNA不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，大量存在于真核細胞中，具有一定的組織、時序和疾病特異性，在轉錄、翻譯以及轉錄后調(diào)控等多種層面上影響基因的表達和功能，廣泛參與機體各種生理和病理過程[4-6]。同時，環(huán)狀RNA的異常表達與包括惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[7，8]。隨著環(huán)狀RNA研究的進一步深入，越來越多的證據(jù)表明環(huán)狀RNA表達譜會隨著疾病進程發(fā)生變化，同時，環(huán)狀RNA能夠穩(wěn)定存在外周血中，其檢測對于疾病診斷判斷預后具有重要意義[9]。在前期工作中，課題組采用高通量基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)肺結核患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC） 中 circRNF10（又名hsa_環(huán)狀RNA_005086）表達顯著升高[10]，提示其可能作為結核病診斷標志物。因此，本研究旨在檢測circRNF10在肺結核病患者PBMC中的表達水平，探討其在肺結核病診斷、療效監(jiān)測中的價值。

1 資料與方法

1.1 病例資料 ⑴肺結核組：收集2016年3月至2017年3月江西省胸科醫(yī)院結核科收治的初治活動性肺結核患者90例，男58例，女32例，平均年齡（40.5±12.4）歲。肺結核的診斷依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學會《臨床診療手冊（結核病分冊）》診斷標準[11]，并除外心、肝、腎等臟器并發(fā)癥。90例肺結核患者依據(jù)肺部病灶所占的范圍、肺部有無空洞進行分組，經(jīng)胸部CT診斷，按照肺部有無空洞分為無空洞組57例和有空洞組33例；據(jù)影像學肺部病灶所占的范圍分為＜2個肺野組51例，≥2個肺野組39例。所有肺結核患者均在抗結核治療前采血。肺結核患者給予規(guī)范化治療：異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺2個月，異煙肼+利福平4個月。20例肺結核患者均在規(guī)范化抗結核治療3月和6月后采血。⑵肺炎組：收集同期南昌大學第一附屬醫(yī)院住院肺炎患者40例，其中男26例，女14例，平均年齡（37.9±11.8）歲。入組病例均未接受過放、化療及其他免疫治療、無結核病接觸史。⑶肺癌組：收集同期南昌大學第一附屬醫(yī)院住院肺癌患者40例，其中男27例，女13例，平均年齡（45.5±9.7）歲。入組病例均經(jīng)過病理診斷確診，未接受過放、化療及其他免疫治療、無結核病接觸史。⑷健康對照組：收集同期南昌大學第一附屬醫(yī)院進行體檢的健康人70例，其中男46例，女24例，平均年齡（38.7±11.6）歲。入組對象胸部影像學檢查均正常，無結核病接觸史。

所有對象均排除合并高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物的患者；排除HBV、HCV、HIV感染者或 （和）AIDS患者；排除孕婦或哺乳期婦女。本研究經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，標本的收取及患者信息的使用已獲得患者及家屬知情同意，所有患者及志愿者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉錄試劑及實時熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司；Trizol試劑及熒光定量PCR引物購自美國Invitrogen公司；Ficoll淋巴細胞分離液購自美國sigma公司；熒光定量PCR儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 采集研究對象空腹靜脈血，EDTA-K2抗凝，按常規(guī)方法用Ficoll淋巴細胞分離液提取PBMC。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成 向PBMC細胞沉淀物中加入1ml Trizol試劑，按Trizol試劑說明書提取PBMC樣本總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。取1μl RNA，按照說明書，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR 采用SYBR法進行實時熒光定量PCR檢測，檢測步驟及反應條件參照試劑盒說明書進行。circRNF10上游引物為：5'-ACCTGCTCCTCTGATTCTGCT-3'，下游引物為 5'-GGTGAGTGGCAAGTGAGAGA-3'；內(nèi)參 β-actin 基因上游引物為5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGG-3'，下游引物為5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。 反應體系為 20μl，即：1×SYBR Green I mastermix、0.5μmol/L 特異前向引物、0.5μmol/L 特異反向引物、1μl反轉錄產(chǎn)物。反應條件為：預變性95℃10min，95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 30s，40 循環(huán)，通過熔解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性。熒光定量PCR檢測使用ABI 7500儀器進行。每孔均設3個復孔，取平均Ct值做為該樣本最后Ct值，以βactin基因作為內(nèi)參基因，計算2-△△Ct值反映circRNF10表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。以Kolmogorov-Smirnov檢驗（K-S檢驗）對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析。采用GraphPad Prism 5軟件繪制受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）， 并計算曲線下面積 （area under of ROC curve，AUC）評估PBMC中circRNF10的檢驗效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同分組circRNF10表達水平比較分析 采用實時熒光定量PCR檢測PBMC中circRNF10在各亞組中表達情況[肺結核組（2.11±1.13）；健康對照組（1.00±0.38）；肺炎組（1.14±0.57）；肺癌組（0.93±0.31），發(fā)現(xiàn)肺結核患者circRNF10表達相比健康對照組、肺炎組和肺癌組表達高（F=38.15，P＜0.01；圖1），其余3組PBMC中circRNF10表達無明顯差異（F=2.75，P=0.07）。

圖1 不同分組中PBMC中circRNF10表達水平的散點圖

2.2 circRNF10表達與肺結核病灶范圍及肺部空洞的關系 根據(jù)肺結核患者肺部空洞的情況分為無空洞組和有空洞組（圖2A），檢測結果顯示，有空洞組 PBMC 中 circRNF10 表達（3.00±1.13）顯著高于無空洞組 （1.60±0.76），差異有統(tǒng)計學意義 （t=7.02，P＜0.01）。根據(jù)影像學肺部病灶所占的范圍分為＜2個肺野組和≥2個肺野組（圖2B），檢測結果顯示，≥2個肺野組 PBMC中 circRNF10表達（2.68±1.18）顯著高于＜2 個肺野組（1.67±0.87），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.68，P＜0.01）。

圖2 肺部不同病灶范圍及肺部空洞組患者PBMC中circRNF10表達水平的散點圖

2.3 抗結核治療前后PBMC中circRNF10表達變化 我們對已收治的20例初治肺結核患者均進行了6個月的隨訪，檢測患者接受抗結核治療3個月及6個月后PBMC中circRNF10的表達變化。隨訪結果顯示，隨訪患者抗結核治療效果良好。熒光定量PCR檢測結果如圖3所示，與治療前circRNF10表達水平 （2.31±0.72）相比，治療3月（1.27±0.41）（t=5.62，P＜0.01）、6 月 （0.94±0.38）（t=7.54，P＜0.01）circRNF10 的表達水平均顯著下降。與治療3月組相比，治療6月組circRNF10的表達水平顯著降低（t=2.63，P=0.01）。此外，接受治療6月組PBMC中circRNF10水平與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.69，P=0.49）。

圖3 肺結核患者抗結核治療前后PBMC中circRNF10表達水平的散點圖

2.4 circRNF10對結核病的診斷效能 為了評估PBMC中circRNF10的診斷效能，我們繪制了肺結核患者區(qū)別于健康對照組及肺炎、肺癌的ROC曲線。結果如圖4所示，circRNF10在用于區(qū)別肺結核患者與健康對照者（圖4A）、肺炎患者（圖4B）及肺癌患者 （圖 4C）的 AUC分別為 0.837、0.782、0.861。以1.37為臨界值，circRNF10鑒別肺結核患者與健康對照的敏感度和特異度分別為88.57%和73.33%；以1.22為臨界值，circRNF10鑒別肺結核患者與肺炎患者的敏感度和特異度分別為70.00%和80.00%；以1.26為臨界值，circRNF10鑒別肺結核患者與肺癌患者的敏感度和特異度分別為87.50%和77.78%。

圖4 circRNF10診斷肺結核病的ROC曲線

3 討論

環(huán)狀RNA（circRNA）是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型非編碼RNA分子，通常由前體mRNA經(jīng)可變剪切產(chǎn)生，具有閉合環(huán)狀結構，也是目前RNA領域最新的研究熱點分子[12]。盡管目前大多數(shù)環(huán)狀RNA的生物學功能尚不明確，但不少研究表明，環(huán)狀RNA分子因富含微小RNA（microRNA，miRNA）結合位點，在細胞中起到一種類似于“miRNA海綿”的作用，它可以解除miRNA對其靶基因的抑制，從而提高靶基因表達水平[13]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)部分環(huán)狀RNA可通過與RNA聚合酶Ⅱ相結合從而促進基因轉錄[14]，或充當RNA結合蛋白海綿，調(diào)控有關蛋白質(zhì)的活性[15]，在人體多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)一些特定的環(huán)狀RNA具有疾病和組織特異性，人血清、血漿、唾液及其他體液中均有環(huán)狀RNA表達，而且循環(huán)環(huán)狀RNA具有良好的穩(wěn)定性，這種穩(wěn)定性也為其作為疾病診斷的標志物奠定了基礎[16]。如，Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)了外周血hsa_circ_0124644可作為冠心病的一個診斷性生物標志物。Teng等[18]發(fā)現(xiàn)了外周血hsa_circ_0021001可作為篩查顱內(nèi)動脈瘤的新型生物標志物。此外，近期Ouyang等[19]研究發(fā)現(xiàn)PBMC 中 hsa_circ_104871，hsa_circ_003524，hsa_circ_101873和hsa_circ_103047可作為類風濕關節(jié)炎診斷的標志物。目前環(huán)狀RNA在結核病中研究尚剛起步，相關研究鮮有報道。

本課題組前期通過高通量芯片技術篩選發(fā)現(xiàn)，與健康對照者比較，肺結核患者PBMC中環(huán)狀RNA表達譜發(fā)生部分變化[10]。本實驗中，我們以變化顯著的circRNF10為研究對象，探討其對肺結核的診斷價值。結果顯示，相比于肺炎、肺癌患者及健康人群，肺結核患者PBMC中circRNF10的表達量升高。AUC結果顯示circRNF10能區(qū)別肺結核患者與健康人及肺炎、肺癌患者，可作為診斷肺結核的有效標識。進一步據(jù)肺部病灶范圍、肺部空洞不同臨床表型進行分組分析，結果顯示，肺部有空洞結核患者PBMC中circRNF10水平顯著高于無空洞患者，肺部病灶范圍大的患者顯著高于病變范圍小患者。提示PBMC中circRNF10水平在一定程度上或可反映肺結核炎癥組織損傷的嚴重程度。

本研究對部分初治肺結核患者隨訪6個月，期間患者嚴格按照標準抗結核治療方案接受治療，均未接受放化療及激素治療等其他治療，且患者抗結核治療效果良好。結果發(fā)現(xiàn)與未接受治療組患者相比，circRNF10在抗結核治療3個月時表達明顯下降，且隨著治療時間延長，circRNF10表達量逐漸降低。當接受6個月抗結核治療后，隨訪患者中circRNF10表達量已下降至正常水平，與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異。需要指出的是，由于本研究收集樣本的時間較短，在90例肺結核患者中僅有20例患者均在規(guī)范化抗結核治療3月和6月后完成采血。由于病例數(shù)較少，在其用于抗結核治療效果評估時易出現(xiàn)誤差。在下一步研究中，我們將在擴大樣本量的同時對肺結核患者進行定期隨訪，以進一步分析PBMC中circRNF10的表達水平在肺結核患者抗結核療效評價中的意義。

綜上所述，circRNF10在肺結核患者PBMC中表達升高，有望成為結核病快速診斷的潛在生物標志物，同時或可用于抗結核治療效果評估，但是circRNF10的調(diào)控機制仍未清楚，我們希望通過更多研究來了解circRNF10在結核病中是如何發(fā)揮作用的。