宋新慧 商延 張慶 宋勝敏 柳林 由佳 朱應民 齊靜 李璐璐 胡明 駱延波 張印 戴美學 劉玉慶
摘要:抗藥性沙門氏菌的出現,嚴重影響了抗生素對沙門氏菌病的治療效果,而噬菌體治療是一種可能的替代方法。本試驗研究了沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ的基本生物學特性及其對沙門氏菌SM86的治療效果。噬菌體vB_SalS_DZ的生物學特性分析顯示其效價可達109 pfu/mL,透射電鏡結果顯示該噬菌體屬于有尾目T4噬菌體。對pH值的適應范圍寬,在pH值4~12內能保持較高的裂解活性;該噬菌體的最適pH值在5.0左右。最佳感染復數為10-6,感染宿主菌的潛伏期和爆發(fā)期均為60 min;基因組中不攜帶抗性基因和毒力基因。噬菌體vB_SalS_DZ可以使感染沙門氏菌病的SPF雞死亡率降低50個百分點,這表明該噬菌體在治療特定的沙門氏菌感染中具有較大的應用潛能。
關鍵詞:沙門氏菌;噬菌體;生物學特性;噬菌體治療
中圖分類號:S852.6文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2018)07-0042-06
Abstract The emergence of drug-resistant Salmonella seriously affected the therapeutic effect of antibiotics on salmonellosis, and bacteriophage therapy was a possible alternative. This study explored the basic biological characteristics of Salmonella phage vB_SalS_DZ and its therapeutic effect on Salmonella SM86. The biological characteristics of Salmonella phage vB_SalS_DZ showed that the titer was 109 pfu/mL. The results of transmission electron microscopy showed that the phage belonged to the T4 phage. It had a wide adaptation range to pH, and maintained high cleavage activity at pH 4~12. The optimum pH of the phage was about 5.0. Its optimal multiplicity of infection was 10-6, and the incubation period and outburst period were both about 60 min. The genome did not carry resistance genes and virulence genes. Animal experiments showed that phage vB_SalS_DZ could reduce the mortality of SPF chicken infected with salmonellosis by 50 percent points, which indicated that the phage vB_SalS_DZ had great potential in the treatment of specific Salmonella infection.
Keywords Salmonella; Phage; Biological characteristics; Phage therapy
沙門氏菌病是具有重要公共衛(wèi)生影響的人畜共患病之一,是禽場面臨的一個主要問題[1]??股匾恢币詠肀蛔鳛橹委熂毦腥镜氖走x,但隨著抗生素的不合理使用,抗藥性沙門氏菌已嚴重影響抗生素的治療效果[2]。同時,抗生素種類有限且新型抗生素研發(fā)困難使得噬菌體作為抗生素的替代品重新受到關注[3-5]。
噬菌體在自然界中廣泛存在,是專門裂解細菌的一種病毒,其生命周期與細菌嚴格相關。Twort[6]在1915年發(fā)現了噬菌體可以抑制細菌生長,但在1917年DHerelle[7]第一次分離和鑒定出噬菌體。與抗生素相比,噬菌體特異性好,表現為僅感染一種細菌、血清型或毒株,這種作用機制不會導致共生腸道菌群的破壞。在治療期間噬菌體可以自我復制,因此可以使用低劑量的噬菌體達到治療效果。另外,噬菌體不能與真核細胞結合并在其中復制,對真核細胞沒有毒性[8]。目前已有研究分離到了可以有效減少動物腸道沙門氏菌數目的噬菌體,但是明顯降低死亡率的噬菌體報道較少。同時,因為噬菌體的高度特異性,需要針對不同地方的流行菌株進行研究,以達到最佳的應用效果[9,10]。
本研究從山東省分離出沙門氏菌流行菌株,針對性篩選沙門氏菌噬菌體并對其進行了理化性質試驗和基因組測序分析,并使用SPF雞進行了動物試驗,檢測了噬菌體vB_SalS_DZ對雞沙門氏菌病的治療效果。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 培養(yǎng)基和試劑 SM緩沖液(Tris 6.057 g,加濃鹽酸調至pH=7.5,加入5.8 g NaCl和2 g MgSO4·7H2O,定容至1 000 mL)、LB半固體培養(yǎng)基(0.6% 瓊脂)、Dnase I和Rnase A、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、平衡酚溶液、酚-氯仿-異戊醇、無水乙醇、PEG 8000等;0.22 μm濾膜濾器。
1.1.2 菌株和供試動物 沙門氏菌流行菌株SM86,由山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(Varms)提供;沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ;健康的3日齡SPF雞50只,購自山東省農業(yè)科學院家禽研究所SPF雞場。
1.2 噬菌體vB_SalS_DZ的基本生物學特性分析
1.2.1 雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(滴度) 參照文獻[11]中的方法富集噬菌體vB_SalS_DZ,利用雙層平板法測定效價。
1.2.2 噬菌體vB_SalS_DZ的電鏡形態(tài) 參照文獻[12]中的方法,純化得到噬菌體顆粒后進行透射電鏡觀察。
1.2.3 噬菌體最適生長溫度測定 噬菌體原液使用LB液體培養(yǎng)基10倍梯度稀釋,取100 μL稀釋后的液體,與100 μL菌液混合,倒雙層平板,分別置于20、30、37、40℃和50℃下培養(yǎng)4~6 h,觀察結果,噬菌斑計數得到效價,每個溫度3個平行。
1.2.4 噬菌體pH值穩(wěn)定性測定 事先制備pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的液體LB培養(yǎng)基,各取100 μL與等體積的噬菌體原液混勻,置于37℃作用2 h后取出,10倍稀釋后做雙層平板測定效價,每個pH值3個平行。
1.2.5 噬菌體最佳感染復數(MOI)測定 取新鮮菌液,離心后用新鮮的LB液體培養(yǎng)基進行洗滌,利用分光光度計將菌液濃度調至1.0×108 cfu/mL(為較為準確地定量該數值,可以通過預試驗設置不同濃度的菌液進行同一倍數的稀釋后測定吸光度,建立標準曲線,定位108 cfu/mL的菌液的吸光值)。設置MOI的比例分別為10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102,將等量的噬菌體液體與宿主菌液混勻后,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 h,10 000 r/min離心1 min得到噬菌體原液,10倍稀釋后雙層平板測定各個MOI的效價,感染復數最高者即為該噬菌體的最佳MOI。每組3次重復。
1.2.6 噬菌體一步生長曲線測定 按照最佳感染復數的比例將噬菌體與宿主菌等體積(500 μL)混合,37℃作用15 min,10 000 r/min離心1 min,棄上清。沉淀用LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次,使未吸附到宿主菌上的游離噬菌體完全洗脫。上述重懸液迅速加入到10 mL已于37℃預熱的新鮮LB液體中,37℃振蕩培養(yǎng)。每過20 min取樣一次測定效價,以時間為橫坐標、效價為縱坐標繪制一步生長曲線。3個重復。
1.3 噬菌體基因組測序分析
使用蛋白酶K/SDS法提取噬菌體基因組DNA,利用Illumina的Hiseq平臺測序(上海美吉生物技術公司),組裝得到噬菌體基因組后進行分析。
采用RAST網站對噬菌體基因組進行注釋。登錄該網站后,上傳基因組文件,設定具體物種分類后提交,注釋結束后下載注釋結果。利用Geneious軟件將上述注釋結果添加到基因組上,進行可視化分析。
1.4 噬菌體vB_SalS_DZ治療沙門氏菌SM86的效果試驗
注射攻毒,沙門氏菌SM86濃度為109 cfu/mL,噬菌體vB_SalS_DZ效價為109 pfu/mL,按以下分組進行試驗,觀察治療效果。
A:空白對照組:200 μL 生理鹽水,SPF雞10只;
B:噬菌體對照組:100 μL vB_SalS_DZ +100 μL 生理鹽水,SPF雞10只;
C:細菌對照組:100 μL SM86+100 μL 生理鹽水,SPF雞10只;
D:噬菌體治療組1:100 μL vB_SalS_DZ +100 μL SM86,SPF雞10只;
E:噬菌體治療組2:200 μL vB_SalS_DZ +100 μL SM86,SPF雞10只。
2 結果與分析
2.1 噬菌體vB_SalS_DZ的形態(tài)學觀察
噬菌體vB_SalS_DZ的噬菌斑為直徑2 mm左右的透明斑(圖1A),為典型的裂解性噬菌體的噬菌斑形態(tài)。電鏡觀察結果表明,噬菌體形態(tài)基本為正二十面體頭部與細長尾部結構,其中頭部直徑50 nm左右,尾部長度在140 nm左右,尾部末端有細且短的尾絲存在。
2.2 噬菌體vB_SalS_DZ的生物學特性測定
噬菌體vB_SalS_DZ于宿主菌LB培養(yǎng)液中過夜振蕩培養(yǎng)后,經測定效價為109 pfu/mL。
噬菌體vB_SalS_DZ的最適生長溫度在37℃左右(圖2A),這也是沙門氏菌的最適生長溫度,說明噬菌體只有寄生于活細胞內才能進行復制增殖;噬菌體vB_SalS_DZ在pH值高于3時都較為穩(wěn)定(圖2B),在高pH值(>9)時效價略有降低,該噬菌體具有較好的pH穩(wěn)定性;噬菌體vB_SalS_DZ的最佳感染復數為10-6(圖2C),最佳感染復數較低;一步生長曲線(圖2D)表明噬菌體vB_SalS_DZ有60 min的潛伏期,裂解期也在60 min左右。
2.3 噬菌體vB_SalS_DZ的基因組測序
測序結果顯示,噬菌體vB_SalS_DZ的基因組大小為42.4 kb,GC含量為49.5%?;蚪M注釋結果如圖3所示,包含基本的結構蛋白、DNA聚合酶以及細胞裂解酶,但是沒有抗藥基因和毒力基因。
2.4 噬菌體vB_SalS_DZ對雞沙門氏菌病的治療效果
如圖4所示,只注射生理鹽水的A組SPF雞全部存活,注射噬菌體和生理鹽水的B組SPF雞也全部存活,說明噬菌體是安全的。注射沙門氏菌SM86和生理鹽水的C組,只有4只SPF雞存活,而之后采用噬菌體治療的D組和E組,SPF雞的存活率分別達到90%和80%。試驗結果表明,噬菌體治療可有效降低感染沙門氏菌病雞的死亡率。
3 討論與結論
沙門氏菌的噬菌體廣泛分布于雞消化道、雞場及周邊環(huán)境中,這些噬菌體可以在一定程度上替代抗生素,降低細菌抗藥性,提高養(yǎng)殖企業(yè)的經濟利益[13]。
本試驗分離到的沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ效價可達到109 pfu/mL,由正二十面體和尾部組成,屬于T4類噬菌體,這也是噬菌體研究中最常見的一種噬菌體[12,14,15]。噬菌體vB_SalS_DZ的最佳感染復數為10-6,已報道噬菌體的最佳感染復數一般在0.01~0.10[16-18],本株噬菌體的最佳感染復數低,說明可以使用低劑量的噬菌體達到較好的治療效果。感染宿主菌的潛伏期為60 min,爆發(fā)期為60 min。潛伏期和爆發(fā)期短,可以在短時間內殺死宿主菌,有效控制沙門氏菌的生長。對pH值的適應范圍較寬,在pH值4~12間能保持較高的裂解活性。
噬菌體基因組中攜帶抗性基因和毒力基因,在噬菌體應用過程中可能會導致兩種基因的水平轉移,所以在應用之前對其進行基因測序就顯得尤為重要。本研究對噬菌體vB_SalS_DZ基因組的測序結果證實,基因組中不存在抗性基因和毒力基因,這也說明本噬菌體對于生態(tài)環(huán)境是安全的,不會引入新的基因污染。
噬菌體vB_SalS_DZ的生物學特性決定了本株噬菌體具有相當好的應用前景。首先,生產過程中不需要嚴苛的環(huán)境;其次由于其較低的最佳感染復數,減少了噬菌體的使用劑量,降低了使用成本;另外,基因組測序結果也證實了本株噬菌體的安全性。
噬菌體的治療效果取決于效價、應用形式和類型以及應用期。在家禽中長期使用噬菌體已被證明可以減少定植于消化道的沙門氏菌[19]。Fiorentin等[20]的研究也表明,單劑量口服1011 PFU的噬菌體混合物可將腸炎沙門氏菌菌株的發(fā)生率降低3.5個對數單位。噬菌體治療的積極效果也可以在蛋雞群中防治由雞沙門氏菌菌株引起的水平感染中觀察到[21]。本研究中,噬菌體vB_SalS_DZ的動物治療試驗表明,使用噬菌體可以有效降低感染沙門氏菌的雞的死亡率。未使用噬菌體的試驗組,死亡率在60%,而使用100 μL和200 μL噬菌體治療的試驗組,死亡率分別降低至10%和20%,這充分證實了噬菌體的治療效果。但是需要指出的是,200 μL噬菌體的治療效果要低于100 μL噬菌體的治療效果,這可能是由于試驗誤差所致,另外,也說明了100 μL的劑量已經可以達到最佳治療效果。
本試驗對噬菌體vB_SalS_DZ的基本性質和治療效果進行了研究,發(fā)現有較好的應用潛力,可以有效治療雞沙門氏菌病。在抗生素抗藥性日益嚴重的背景下,噬菌體具有很大的應用潛力,也被視為最有效的抗生素替代方法。噬菌體制劑的發(fā)展可能是未來對抗人和動物細菌性疾病的最有效方法之一,也使獲得安全且不含抗生素的食品成為可能。
參 考 文 獻:
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