陳文華 譚會(huì)穎 劉政 邴帥 鄭曉文 王安冉 徐凌川

摘要：從山東省濟(jì)南市佛慧山采集到一株寄生于君遷子（Diospyros lotus L）種子上的擬青霉屬（Penicilliopsis）真菌，經(jīng)系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究和DNA分子測(cè)序，確定其為中國(guó)大陸新記錄種Penicilliopsis clavariaeformis Solms，并將其命名為“珊瑚擬青霉”。選擇多種培養(yǎng)基對(duì)該菌株進(jìn)行培養(yǎng)并對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行了觀察。

關(guān)鍵詞：中國(guó)大陸；新記錄種；珊瑚擬青霉

中圖分類(lèi)號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0145-04

Abstract One Penicilliopsis fungus was isolated from seeds of Diospyros lotus L. collecting from Fohui Mountain in Jinan of Shandong Province. After systematic taxonomy and DNA molecular sequencing， it was identified as Penicilliopsis clavariaeformis Solms， a new record species in the Chinese mainland. A variety of culture media were selected for culturing the strain and its morphological characteristics were observed.

Keywords Chinese mainland； New record species； Penicilliopsis clavariaeformis

擬青霉屬真菌是蟲(chóng)生真菌中的重要類(lèi)群，現(xiàn)記錄約50種，其中許多是重要的害蟲(chóng)自然控制因子，有些是害蟲(chóng)生物防治的重要材料。

Penicilliopsis clavariaeformis是Penicilliopsis pesudocordyceps的無(wú)性型，Penicilliopsis pesudocordyceps的全型是Pesudocordyceps seminicola[1]。臺(tái)灣收集到的Pesudocordyceps seminicola在自然生長(zhǎng)的成熟子座上發(fā)現(xiàn)了子囊孢子。Penicilliopsis clavariaeformis曾在印度的紅樹(shù)林采集到，并通過(guò)鹽堿性實(shí)驗(yàn)表明其具有耐鹽堿性，可調(diào)節(jié)碳代謝，在糖酵解、磷酸戊糖途徑中具有重要作用[2]。Penicilliopsis clavariaeformis結(jié)晶純化可得到代謝產(chǎn)物penicilliopsin，該代謝產(chǎn)物是一種橘黃色的色素物質(zhì)，分離提取得到醌茜素或大黃素[3，4]，這兩種物質(zhì)具有抗抑郁或抗腫瘤活性[5-9]。

2016年作者在山東進(jìn)行水生、耐鹽中藥資源普查時(shí)發(fā)現(xiàn)一株擬青霉屬真菌，寄生于君遷子的種子上，形成珊瑚狀的子實(shí)體，經(jīng)過(guò)人工培養(yǎng)和分子鑒定，確定其為珊瑚擬青霉。該真菌曾于2002年在中國(guó)臺(tái)灣報(bào)道過(guò)[1]，本研究為首次在中國(guó)大陸報(bào)道，君遷子種子為珊瑚擬青霉新寄主。本試驗(yàn)使用不同的固體培養(yǎng)基對(duì)珊瑚擬青霉菌進(jìn)行初步優(yōu)化，通過(guò)人工培養(yǎng)、系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究及DNA分子鑒定對(duì)該真菌形態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)描述，為今后進(jìn)一步研究珊瑚擬青霉的抗抑郁和抗腫瘤活性及開(kāi)發(fā)相應(yīng)的微生物菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樣品 珊瑚擬青霉從君遷子種子中分離、純化得到，采于濟(jì)南市佛慧山，由山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定。標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC：14129。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 PH100-DB500U數(shù)碼生物顯微鏡（鳳凰光學(xué)）；SUPRATM55熱場(chǎng)掃描電子顯微鏡（德國(guó)蔡司）；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司）；Blospin植物基因組DNA提取試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固體培養(yǎng)基的制備 （1）察氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基：硝酸鈉 0.9 g；氯化鉀 0.15 g；硫酸鎂 0.15 g；硫酸亞鐵 0.03 g；酵母 1.5 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；蔗糖 9 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（2）燕麥瓊脂培養(yǎng)基：燕麥 12 g；葡萄糖 6 g；蔗糖 3 g；蛋白胨 0.6 g；硫酸鎂 0.15 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（3） 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁 20 g；蛋白胨 0.3 g；葡萄糖 6 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（4）25%甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基：硝酸鈉 0.9 g；氯化鉀 0.15 g；硫酸鎂 0.15 g；硫酸亞鐵 0.03 g；酵母 1.5 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；甘油 78 mL；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

1.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察 從25℃培養(yǎng)7 d的四種固體培養(yǎng)基中分別挑取少量的菌絲置于顯微鏡下觀察，以菌落生長(zhǎng)的快慢、大小、濃密程度、顏色、質(zhì)地和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子梗（分支狀況，簡(jiǎn)單，復(fù)雜，長(zhǎng)短）的形態(tài)特征（幾輪生、大?。┳鳛殍b別主要依據(jù)。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）觀察 取少量在燕麥培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)7 d的菌絲，采用冷凍干燥法干燥，用液氮研磨成粉末作為樣品，將少量菌絲樣品置于標(biāo)本托上，雙面膠固定，噴金10 min，采用熱掃描電鏡觀察珊瑚擬青霉菌絲及孢子形態(tài)特征。

1.2.4 分子鑒定 用Blospin植物基因組DNA試劑盒提取菌株總DNA，利用通用引物ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增菌株ITS序列，通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq master mix 25 μL、DNA模板4 μL、ITS1引物 2 μL （2.5 μmol/L）、ITS4引物 2 μL （2.5 μmol/L）、ddH2O 17 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 mim，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，產(chǎn)物于-4℃冰箱保存。取PCR產(chǎn)物5 μL、EB染液3 μL，利用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚擬青霉在固體培養(yǎng)基的形態(tài)特征

在察氏酵母培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d菌落直徑達(dá)6.5～7.0 cm，菌落中心有白色絨毛，四周灰白色，彌漫到整個(gè)培養(yǎng)基邊緣，背面黃褐色，子座量少而短，米白色；14 d后整個(gè)培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿棒狀子座，長(zhǎng)0.5～1.5 mm，米白色（細(xì)?。┡c淡橄欖綠色（粗大長(zhǎng)滿孢子）相間分布，生長(zhǎng)較濃密，孢子大量分布在子座上部及菌落表面。

在燕麥培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后菌落直徑6.0～7.0 cm，正面棕黃色，背部深黃色。子座直徑0.1～0.3 mm，長(zhǎng)度1.5～6.0 mm，帚狀分支或棒狀，子實(shí)體黃色，尖端淡黃色，生長(zhǎng)相對(duì)濃密。14 d后菌落彌漫到培養(yǎng)基邊緣，柔軟光滑，圓鋸齒狀，子座分支或不分支，不規(guī)則軸向生長(zhǎng)，新鮮時(shí)硫黃色，干燥后變橄欖綠色，背面黃褐色。孢子分布在整個(gè)菌落和子座表面。

在25%甘油硝酸鹽培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d菌落直徑達(dá)4.0～5.0 cm，正面灰白色，背部黃褐色。中心點(diǎn)有少量灰白色細(xì)小棒狀子座，子座周?chē)懿蓟野咨慕q毛。14 d后中心點(diǎn)附近灰白色菌絲濃密，子座長(zhǎng)0.1～0.8 mm，直徑0.1 mm，菌落彌漫到培養(yǎng)基邊緣，呈灰綠色。

在麥芽培養(yǎng)基上，菌落和子座特征與在燕麥培養(yǎng)基上基本相似。

由于燕麥和麥芽都屬于糧食類(lèi)，所以又選用了8種其他常見(jiàn)糧食作為原料培養(yǎng)該真菌并觀察其生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明選用糧食作為主要碳源，菌絲生長(zhǎng)差異不大，且有關(guān)研究表明該菌在燕麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周能產(chǎn)生有性型子囊孢子[1]，所以為了保證有一定菌絲量同時(shí)可能發(fā)現(xiàn)子囊孢子，仍然選擇燕麥作為主要碳源。

2.2 珊瑚擬青霉的形態(tài)特征

野生珊瑚擬青霉棒狀子座直徑0.1～0.2 mm，長(zhǎng)度1.0～7.0 mm，橄欖綠色（圖1A）。

利用光學(xué)顯微鏡觀察燕麥培養(yǎng)基中珊瑚擬青霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)由菌柄、小枝、?；M成。菌柄黃褐色，圓柱形，光滑，分支或不分支，5.0～6.0 μm。每個(gè)菌柄有2～3個(gè)小枝，橄欖綠色，短棒狀或筒狀，6～15 μm。每個(gè)小枝上有3～5個(gè)?；魻?，光滑，頂部有微小的孢子，5～14 μm（圖1B）。每個(gè)梗基上有5～10個(gè)瓶梗，緊密，淡黃色，長(zhǎng)筒狀，3～15 μm。分生孢子由上到下產(chǎn)生，淡黃色到橄欖綠色，卵圓形（4.32 μm ×7.50 μm）到長(zhǎng)橢圓形（3.27 μm × 7.70 μm），光滑或稍粗糙（圖1 C）。

菌絲透明或半透明，光滑，直徑4-7 μm，掃帚狀，對(duì)稱(chēng)，有明顯的分隔（圖1D）。分生孢子梗緊密、光滑，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)帚狀二輪生或者多輪生，孢子梗上有無(wú)色或淡黃色的寬卵形或長(zhǎng)卵形分生孢子，光滑或稍粗糙，單個(gè)排列（圖1B）。

掃描電鏡下珊瑚擬青霉子座形態(tài)光滑或稍微皺縮，密集成簇分布，粗細(xì)大致均勻，表面有明顯的分隔，直徑約4～6 μm（圖1E）。大量分生孢子緊貼在菌絲上，極面觀長(zhǎng)橢圓形或?qū)挋E圓形，赤道面觀近球形。表面皺縮，大小約（6.5～9.5）μm ×（3.5～5.5）μm，形態(tài)飽滿，兩端較尖（圖1F）。

2.3 序列拼接和去除低質(zhì)量區(qū)后ITS堿基序列

將本試驗(yàn)所得的序列利用Blast進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示菌株與Penicilliopsis clavariaeformis Solms同源率為99%，結(jié)合形態(tài)觀察與鑒別，確定該菌株是珊瑚擬青霉。

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)及DNA分子鑒定方法確定該株擬青霉真菌為中國(guó)大陸新記錄種——珊瑚擬青霉。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)由菌柄、小枝、?；M成。分生孢子由上到下產(chǎn)生，淡黃色到橄欖綠色，卵圓形（4.3 μm×7.5 μm）到長(zhǎng)橢圓形（3.3 μm×7.7 μm），光滑或稍粗糙，菌絲透明或半透明，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)帚狀二輪生或者多輪生，標(biāo)本與Samson 等[10]的描述基本一致。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為鑒定珊瑚擬青霉無(wú)性型的主要特征，Pesudocordyceps，Clavariaeformis，Sarophorum和Stilbodendron也有相似的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，二輪生或多輪生[1]。我們?cè)谝吧鸂顟B(tài)下和人工培養(yǎng)的過(guò)程中均未發(fā)現(xiàn)有性型，關(guān)于珊瑚擬青霉有性型的人工培養(yǎng)需作進(jìn)一步的研究。已報(bào)道的珊瑚擬青霉的寄主都是柿子屬的柿子，因此君遷子的種子為新寄主。另外，文獻(xiàn)資料沒(méi)有關(guān)于君遷子種子的藥用記載，我們將進(jìn)一步研究珊瑚擬青霉的液體發(fā)酵最優(yōu)化生長(zhǎng)條件、藥理作用及新寄主君遷子種子的藥用價(jià)值。因此，本研究為珊瑚擬青霉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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