楊成聰，舒娜，張亦舒，付彩霞，趙慧君，郭壯*

(1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜都 443302)

醬油作為家庭必不可少的調(diào)味料，是經(jīng)過微生物發(fā)酵大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或小麥粉等釀制而成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[1]。作為我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，醬油不僅具有調(diào)味增鮮的作用，其更能賦予食物特殊的香味和特有的色澤[2]。醬油按照其作用可大致分為生抽醬油和老抽醬油，老抽醬油香味更加濃郁，常用于鹵制上色，而生抽醬油一般用于炒菜提鮮[3]。GB/T 18186-2000《釀造醬油》、GB 2717-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》均要求醬油應(yīng)具有濃郁的醬香和酯香氣，但其評(píng)價(jià)方式均為感官鑒評(píng)法。感官鑒評(píng)法在一定程度上具有描述模糊，對鑒評(píng)人員要求高且受主觀因素影響較大的不足[4]，因而對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析是極為必要的。目前針對醬油滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)[5]、天然醬油與釀造醬油品質(zhì)比較分析[6]、天然醬油鑒定[7]和醬油抗氧化[8]開展了系列研究，而對生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)差異性評(píng)價(jià)的研究較少。

研究人員多采用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)對食品風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，具有結(jié)果受主觀因素影響小、可信度和重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)[9]。電子鼻通過金屬傳感器可以實(shí)現(xiàn)對不同敏感類型物質(zhì)的定性和定量分析，目前已在食品品質(zhì)檢測[10]、風(fēng)味評(píng)價(jià)[11]、真?zhèn)握鐒e[12]和特征性香氣識(shí)別[13]領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用；GC-MS技術(shù)可對食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究，亦廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味評(píng)價(jià)[14]、游離氨基酸研究[15]、品質(zhì)判別[16]和農(nóng)藥殘留[17]等研究領(lǐng)域。

本研究采用電子鼻和GC-MS聯(lián)合技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段對市售醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析，甄別了造成生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)差異的物質(zhì)，以期為后續(xù)醬油的區(qū)分和品質(zhì)的提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油：16 個(gè)品牌33 個(gè)品名的生抽醬油和8 個(gè)品牌11 個(gè)品名的老抽醬油，均為市售；氯化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SYG-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司；JJ224BC分析天平 常熟市雙杰測試儀器廠；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；GC-MS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HS-20頂空進(jìn)樣器 日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基于電子鼻技術(shù)對醬油中敏感類型物質(zhì)的測定

30 mL醬油樣品稀釋2倍后裝入125 mL GC-MS樣品瓶中，置于60 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，平衡10 min后采用電子鼻對醬油中的敏感類型物質(zhì)進(jìn)行測定，分別由10 個(gè)金屬傳感器對不同敏感類型物質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。10 個(gè)金屬傳感器在測定樣品前會(huì)進(jìn)行95 s的自動(dòng)清潔，然后進(jìn)行60 s自動(dòng)檢測，每秒測定一個(gè)響應(yīng)值，取49，50，51 s時(shí)響應(yīng)值的平均值為對應(yīng)值。響應(yīng)值為金屬傳感器測試樣本時(shí)產(chǎn)生的電阻值G與測試空氣時(shí)的電阻值G0的比值，自動(dòng)清潔時(shí)響應(yīng)值為1，測定樣品時(shí)響應(yīng)值偏離1的程度越大，則說明金屬傳感器所對應(yīng)敏感性物質(zhì)類型濃度越高。

1.3.2 基于GC-MS技術(shù)對市售醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

樣品預(yù)處理：取12 mL醬油樣品于20 mL樣品瓶中，加入2 g氯化鈉振蕩至氯化鈉完全溶解，使用帶聚四氟乙烯的鋁帽封口待用。60 ℃預(yù)熱振蕩30 min，平衡10 min，進(jìn)樣口解吸5 min后進(jìn)入GC-MS分析。

GC測定條件：SH-Rtx-Wax(30 m×2.25 mm×0.25 μm)色譜柱；進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比為8∶1；載氣為高純氦氣(>99.9999%)和高純氮?dú)?>99.9999%)；載氣控制方式：線速度36.0 cm/s；柱溫程序：起始溫度30 ℃，保持6 min，以6 ℃/min升到50 ℃，保持6 min，然后以10 ℃/min升到130 ℃，不保持，然后以15 ℃/min升到200 ℃，保持7 min；進(jìn)樣口溫度180 ℃。

MS測定條件：離子源：EI離子源；離子源溫度：230 ℃；連接口溫度：250 ℃；電子轟擊能量：70 eV；檢測器電壓：相對于調(diào)諧結(jié)果0.1 kV；m/z范圍：41.00～450 amu；采集方式：Q3 Scan。

定性分析保留指數(shù)定性；NIST 14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫定性。

定量分析：采用峰面積百分比對樣本中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行相對定量分析。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)、典范對應(yīng)分析(Canonical Correspondence Analysis，CCA)和多元方差分析(Multivariate Analysis of Variance，MANOVA)對生抽醬油和老抽醬油的風(fēng)味品質(zhì)差異進(jìn)行分析，采用冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)和曼-惠特尼檢驗(yàn)(Mann-Whiney Test)對造成生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)差異的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行甄別。

除使用Cannoco 4.5軟件做RDA分析外，其他分析均采用Matlab 2010b軟件。采用Matlab 2010b軟件繪制熱圖，其他圖均采用Origin 8.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻技術(shù)對生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)的差異性分析

基于電子鼻技術(shù)對市售醬油風(fēng)味品質(zhì)第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的因子得分圖見圖1。

圖1 基于PCA的生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)的PC1和PC2因子得分圖Fig.1 PCA of the flavor quality of light and dark soy sauce samples showing PC1 and PC2 factor scores

由圖1可知，在使用無監(jiān)督的PCA對33 個(gè)生抽醬油樣品和11 個(gè)老抽醬油樣品進(jìn)行空間排布時(shí)，雖然兩類樣品在空間排布上有部分重疊，但亦呈現(xiàn)出一定的分離趨勢。本研究進(jìn)一步采用有監(jiān)督的CCA對上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，基于CCA的生抽醬油和老抽醬油樣品空間排布見圖2。

圖2 基于CCA的生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)Fig.2 CCA of the flavor quality of light and dark soy sauce samples

由圖2可知，生抽醬油樣品主要分布在第二象限和第三象限，而老抽醬油樣品主要分布在第一象限和第四象限。由此可知，兩類樣品的風(fēng)味品質(zhì)存在明顯的差異，經(jīng)MANOVA發(fā)現(xiàn)，兩類醬油風(fēng)味品質(zhì)具有顯著性差異(P<0.05)。由此可見，以生抽和老抽為分組依據(jù)的確是導(dǎo)致44 個(gè)醬油樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯分離趨勢的原因。各傳感器對生抽醬油和老抽醬油響應(yīng)值的差異性分析見表1。

表1 各傳感器對生抽醬油和老抽醬油響應(yīng)值的差異性分析Table 1 Significance analysis of each sensor response of light and dark soy sauce samples

由表1可知，經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)傳感器W5S、W1S、W1W和W2S在生抽醬油樣品中的響應(yīng)值均顯著高于老抽醬油樣品(P<0.05)，而傳感器W1C、W3C和W5C均呈現(xiàn)出相反的趨勢(P<0.05)。由此可見，老抽醬油中芳香類物質(zhì)的含量顯著高于生抽醬油，這可能也是老抽醬油用于鹵制增香的原因。值得一提的是，傳感器W6S、W2W和W3S在兩類醬油樣品中的相應(yīng)值差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 基于GC-MS技術(shù)對生抽醬油和老抽醬油的風(fēng)味品質(zhì)的差異性分析

本研究采用GC-MS技術(shù)從44 個(gè)醬油樣品中共檢測出88 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類化合物12 種、醛類化合物10 種、酸類化合物5 種、酯類化合物15種和酮類化合物10 種。生抽醬油和老抽醬油樣品中不同類型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的比較分析見圖3。

圖3 生抽醬油和老抽醬油揮發(fā)性成分的比較分析Fig.3 Comparative analysis of volatile components in light and dark soy sauce samples

由圖3可知，醛類化合物在生抽和老抽樣品中的相對含量均最高，分別為33.42%和48.32%，其次為醇類化合物，在生抽和老抽樣品中的相對含量分別為29.47%和14.69%。經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩類化合物在生抽醬油和老抽醬油之間的相對含量存在顯著性差異(P<0.05)，而酸類、酯類和酮類化合物在兩類樣品之間差異不顯著(P>0.05)。

本研究進(jìn)一步對醬油樣品中的平均相對含量大于1.0%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4。

圖4 生抽醬油和老抽醬油中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對強(qiáng)度的熱圖Fig.4 Heat map of relative abundance of major volatile flavor compounds in light and dark soy sauce samples

由圖4可知，44 個(gè)醬油樣品中相對含量大于1.0%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括2-甲基丁醛、異戊醛、異丁醛、乙醇、丙酮、3-甲基-4-氧代戊酸、乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、丁酮、3-丁炔-1-醇、2-甲基-1-丁醇、醋酸和(S)-2-甲基-1-丁醇，其平均相對含量分別為14.21%，13.29%，9.37%，9.16%，8.99%，8.43%，5.50%，5.36%，4.78%，4.19%，3.84%，3.15%，1.60%，1.42%。經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇、3-甲基-4-氧代戊酸、異戊醇和異丁醇在生抽醬油中含量顯著偏高(P<0.05)，而異戊醛和醋酸呈現(xiàn)出相反的趨勢(P<0.05)，6種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對強(qiáng)度的箱形圖見圖5。

圖5 6種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量的箱形圖Fig.5 Box plots of the relative abundance of 6 volatile flavor compounds

由圖5可知，異戊醛、乙醇、3-甲基-4-氧代戊酸、異戊醇、異丁醇和醋酸在生抽醬油中的平均含量分別為11.58%，10.89%，10.62%，6.01%，5.66%，0.44%，在老抽醬油中的平均含量分別為18.40%，3.97%，1.88%，3.42%，2.11%，5.07%。本研究進(jìn)一步采用RDA對導(dǎo)致生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味品質(zhì)差異的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了甄別，結(jié)果見圖6。

圖6 RDA雙序圖Fig.6 Biplot of the RDA

由圖6可知，異丁醇、異戊醇、乙醇、醋酸、異戊醛和異丁醛6 個(gè)關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與RDA雙序圖約束軸上的樣品賦值良好相關(guān)，代表了生抽醬油和老抽醬油風(fēng)味差異顯著相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。值得一提的是，異丁醇、異戊醇和乙醇3 個(gè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)位于生抽醬油一側(cè)，醋酸、異戊醛和異丁醛則位于老抽一側(cè)，這表明生抽醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中異丁醇、異戊醇和乙醇的相對含量高于老抽醬油，而醋酸、異戊醛和異丁醛則呈現(xiàn)出相反的趨勢，這與Mann-Whiney檢驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論

采用電子鼻和GC-MS聯(lián)合技術(shù)對市售醬油的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生抽醬油和老抽醬油的風(fēng)味品質(zhì)存在顯著差異，且老抽醬油中芳香類物質(zhì)的含量顯著高于生抽醬油。醛類和醇類化合物為醬油中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙醇、3-甲基-4-氧代戊酸、異戊醇和異丁醇在生抽醬油中含量顯著偏高，而異戊醛和醋酸呈現(xiàn)出相反的趨勢。