章 婷 徐志波

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎或肺氣腫，進(jìn)一步發(fā)展為呼吸衰竭和肺心病的常見慢性疾病。吸煙是COPD發(fā)生的最重要的危險(xiǎn)因素之一，另外還有一些其他的因素也是COPD的易感因素，如炎性細(xì)胞因子、蛋白酶、抗蛋白酶、氧化還原酶和解毒酶等。氧化應(yīng)激的增加也是COPD發(fā)病的關(guān)鍵因素。身體具有完善的酶和非酶抗氧化系統(tǒng)來應(yīng)對氧化應(yīng)激，保護(hù)身體免受氧化劑的攻擊，從而抵抗氧化應(yīng)激引起的氧化損傷，并且保持氧化/抗氧化的動態(tài)平衡。已知的主要氧化抑制酶包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，微粒體環(huán)氧化物水解酶（EPHX1）和血紅素加氧酶。當(dāng)氧化抑制劑的產(chǎn)生減少或由于遺傳變異而使其活性降低時，氧化/抗氧化的動態(tài)平衡喪失，導(dǎo)致氧化損傷。因此，遺傳變異在COPD發(fā)病中也起著重要的作用。關(guān)于EPHX1基因多態(tài)性與COPD及合并肺動脈高壓（PH）的發(fā)病率的相關(guān)性研究較少，本研究旨在探討EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)SNPs與COPD以及并發(fā)PH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2013年10月至2016年12月杭州市富陽區(qū)第二人民醫(yī)院和浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的120例COPD患者作為研究組，其中男71例，女49例；年齡49～76歲，平均（54.25±7.40）歲。COPD合并PH患者54例，COPD非合并PH患者66例。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考2013年修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》［1］。PH診斷標(biāo)準(zhǔn)：超聲心動圖檢查三尖瓣反流速度＞3.4m/s，肺動脈收縮壓≥50mmHg。同期招募體檢中心的健康體檢者85例作為對照組，其中男48例，女37例；年齡48～75歲，平均（53.98±8.55）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：COPD和PH的診斷均符合上述相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有限制性通氣障礙的疾病，如阻塞性睡眠暫停低通氣綜合征、肺栓塞、肺結(jié)核、間質(zhì)性肺病等患者；高血壓患者；先天性心臟病以及動脈粥樣硬化患者；自身免疫性疾病患者；有肝腎損傷性疾病的患者；有服用能夠引起PH的藥物的患者。對照組患者經(jīng)病史檢查和體檢報(bào)告顯示胸片、肺功能以及心臟彩超檢查均無明顯異常。COPD合并PH患者組和COPD非合并PH組患者的年齡、性別、吸煙史、吸煙指數(shù)、FEV1、FEV1/FVC等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）血液樣本的收集和DNA分離：所有受試者于清晨空腹時抽取肘靜脈血4ml，使用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（50）（QIAGEN，51104， 德 國 ） 提 取 基 因 組 DNA。（2）EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)SNPs分型：采用PCR-Sanger的方法，rs1051740位點(diǎn)引物為正向：5'-GATCGATAAGTTCCGTTTCACC -3'， 反 向：5'-ATCTTAGTCTTGAAGTGAGGAT-3'。rs2234922位點(diǎn)正向：5'-CCCCCAGGGCTGGACAT-3'，反向：5'-GTAGAAAGAGCCGGGCCA-3'。PCR反 應(yīng) 體 系：10μmol/L上 下 游 引 物 各 1μl，4μl的 10μmol/L dNTPs，1μl 10×PCR buffer，21μl gDNA 模 板， 補(bǔ)足無菌水至25μl。PCR反應(yīng)程序：94℃，7min預(yù)變性；30個循環(huán)的94℃變性30s，56℃退火，72℃延伸，30s；72℃孵育5min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后采用Sanger測序的方法分析序列信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n或%表示。采用Logistic回歸分析計(jì)算比值比（OR）、95%置信區(qū)間和雙尾P值來評估變異基因型對COPD以及合并HP的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并經(jīng)年齡、性別、吸煙史、吸煙指數(shù)等校正。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征參數(shù)比較 本研究共招募120例COPD患者和85例健康對照組，兩組年齡、性別等參數(shù)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究組具有吸煙史的人數(shù)以及吸煙指數(shù)顯著高于對照組，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD的相關(guān)性 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，研究組患者和健康對照組均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），見表1。研究組患者EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），rs1051740位點(diǎn)C等位基因攜帶者具有更高的COPD患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后OR=1.415，95%CI=1.196～1.630，P=0.000。研究組患者與對照組EPHX1基因rs2234922位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），rs2234922位點(diǎn)A等位基因突變?yōu)镚等位基因后COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無顯著改變，校正后OR=0.992，95%CI=0.477～1.476，P=0.999。

表1 EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD的相關(guān)性［n（%）］

2.4 EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD合并PH的相關(guān)性 COPD合并PH組患者與COPD非合并PH組患者的EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)各基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。分析結(jié)果顯示，EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)T等位基因突變?yōu)镃等位基因和rs2234922位點(diǎn)A等位基因突變?yōu)镚等位基因并不顯著增加COPD患者并發(fā)PH的風(fēng)險(xiǎn)（P＞0.05），見表2。

表2 EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD合并PH的相關(guān)性［n（%）］

3 討論

COPD由肺氣腫、慢性支氣管炎和小氣道的結(jié)構(gòu)性和炎癥性改變組成，其發(fā)病率和病死率均呈現(xiàn)上升趨勢［2］。COPD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，患者的個體間差異較大，除去環(huán)境因素外，基因多態(tài)性在其中也發(fā)揮著重要的作用，目前證實(shí)已有數(shù)種基因多態(tài)性與COPD 有關(guān)［3］。

COPD的病理生理學(xué)包括多種損傷過程，包括炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞和分子肺泡維持程序的改變、異常細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)破壞以及氧化和抗氧化失衡。這些過程由主動或被動的吸煙所產(chǎn)生煙霧觸發(fā)，并由細(xì)胞衰老和感染改變。一系列受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被活性氧和煙草組分激活，導(dǎo)致多種細(xì)胞信號和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)受損，隨后導(dǎo)致慢性氣道反應(yīng)，產(chǎn)生粘液，氣道重塑和肺泡破壞。本研究中具有吸煙史的COPD患者占67.50%，COPD患者吸煙指數(shù)顯著高于健康對照組。因此，COPD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)會顯著增加。香煙煙霧中的許多毒素在肝臟中被代謝，其中幾種解毒酶微粒體環(huán)氧化物水解酶（EPHX1）已被深入研究，發(fā)現(xiàn)EPHX1 SNPs與其活性有關(guān)［4］。EPHX1多態(tài)性與漢族人群COPD相關(guān)性的研究顯示，即使在Logistic回歸模型中調(diào)整了性別、年齡和吸煙指數(shù)等參數(shù)，Y113H與COPD的相關(guān)性也不顯著［5］。

本研究中作者發(fā)現(xiàn)，COPD患者相比健康對照組rs1051740位點(diǎn)C等位基因頻率更高，采用Logistic回歸分析顯示，rs1051740位點(diǎn)C等位基因攜帶者具有更高的COPD患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后OR=1.415，95%CI=1.196～1.630，P=0.000。分析原因可能是由于rs1051740位點(diǎn)T等位基因突變?yōu)镃等位基因后導(dǎo)致EPHX1活性降低，導(dǎo)致芳香族氧化物濃度升高，與共價鍵結(jié)合形成大分子物質(zhì)，發(fā)生免疫反應(yīng)。另外，本研究結(jié)果顯示，COPD患者與對照組EPHX1基因rs2234922位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），rs2234922位點(diǎn)A等位基因突變?yōu)镚等位基因后COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無顯著改變校正后 OR=0.992，95%CI =0.477 ～1.476，P=0.999。在一項(xiàng)針對高加索人群的研究顯示，rs2234922位點(diǎn)SNPs與COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［6］，而在亞洲人群中并無這種相關(guān)性［7］，分析原因可能與人種差異有關(guān)。另外本研究結(jié)果還顯示，EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)T等位基因突變?yōu)镃等位基因和rs2234922位點(diǎn)A等位基因突變?yōu)镚等位基因并不顯著增加COPD患者并發(fā)PH的風(fēng)險(xiǎn)（P＞0.05），說明EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與COPD并發(fā)PH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間并無相關(guān)性，可能由于本研究樣本量大小所限，并未收集到較多的突變純合子樣本，影響了統(tǒng)計(jì)分析的準(zhǔn)確性，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量予以證實(shí)。

綜上所述，EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)C等位基因是COPD的患病危險(xiǎn)因素，rs2234922位點(diǎn)SNPs與COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無顯著相關(guān)性。EPHX1基因rs1051740位點(diǎn)和rs2234922位點(diǎn)SNPs與COPD合并PH并無顯著相關(guān)性。