孫成群 任應(yīng)清 程 堅 張炯華 王茉莉 袁樂麗

骨折是指骨結(jié)構(gòu)的連續(xù)性發(fā)生部分或完全斷裂，多發(fā)于兒童和老年人，但目前由于各方面的原因，骨折發(fā)生的數(shù)量顯著增加。骨折的愈合從生理、組織及生化角度可以劃分為5個階段：誘導(dǎo)期、炎癥期、軟骨痂期、硬骨痂期和重建期，5個階段互為重疊［1］，其愈合過程是相當(dāng)繁雜的，過程受到多種激素及因子的影響，如骨基質(zhì)中大量存在的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），在人體內(nèi)其表達(dá)量是酸性成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF）的10倍。在人體內(nèi)bFGF可以促進(jìn)骨折早期的軟骨修復(fù)，同時具有促進(jìn)血管增殖的作用。有研究也報道局部或全身應(yīng)用bFGF可以加速骨和軟骨的形成，縮短骨折愈合時間［2］。而骨折發(fā)生時常伴隨周圍組織及血管的破壞，導(dǎo)致骨折斷端出現(xiàn)血流障礙，造成愈合過程緩慢，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有誘導(dǎo)血管新生的作用［3］。雖然目前臨床上治療骨折的方法較多，但骨折愈合過程中內(nèi)固定、生長因子及血流量的供給仍然是關(guān)鍵的不可或缺因素，因此，本文主要從生長因子及血流量的供給來深入探究bFGF對骨折愈合過程中VEGF表達(dá)的影響及二者在促進(jìn)骨折愈合中的作用。

1 臨床資料

1.1 材料 動物：健康雄性SD大鼠共40只，體重240～270g。藥品及試劑：10%水合氯醛（行知生物科技有限公司），生理鹽水（西安悅來醫(yī)藥科技有限公司），bFGF（武漢禾元生物科技有限公司），戊巴比妥（上海西隴化工有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司），10%乙二胺四乙酸鈉（河北誠信有限責(zé)任公司），無水酒精（廣東中能酒精有限公司），VEGF多克隆抗體試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司），蘇木紫-伊紅染色試劑（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），DAB（Diaminobenzidine）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SABC（strept avidin-biotin complex）免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技有限公司。儀器：注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司），克氏針（深圳佰慕斯精密科技有限公司），電子天平（FA2004A型號，上海精天），低溫冰箱（三洋公司，日本），石蠟切片機、石蠟包埋機（沈陽謄德電子儀器有限公司），生物顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（日本）；離心機（80-2型，上海），Mias-2000圖像分析系統(tǒng)及MIPRD圖像處理軟件（南京天龍光電儀器廠）。

1.2 實驗方法 （1）分組與造模［4］：按照隨機數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠隨機均分為2組：對照組和觀察組各20只大鼠，然后再分別將對照組、觀察組按照造模后 7d（D7）、14d（D14）、21d（D21）、28d（D28）4個時間點隨機均分，每個時間點5只大鼠。參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行造模：所有大鼠均采用水合氯醛麻醉法麻醉（10%，0.25ml/100g），待麻醉滿意后采用正規(guī)手術(shù)方法用線鋸斷脛骨，然后用合適直徑的克氏針進(jìn)行髓腔內(nèi)固定，用生理鹽水沖洗后縫合傷口，傷口無菌包扎。造模后立即對觀察組（20只）所有大鼠的骨折斷端注射bFGF（600μg/kg，注射1次/2d），對照組用同樣的方法在大鼠骨折斷端注射生理鹽水。（2）取樣：觀察組及對照組分別在造模后D7、D14、D21、D28注射過量戊巴比妥處死5只大鼠，截取胚骨制作骨痂標(biāo)本。將標(biāo)本固定在4%多聚甲醛溶液中24h，然后流水沖洗12h，用10%的乙二胺四乙酸鈉室溫下脫鈣21d，使用梯度酒精法脫水。用石蠟沿骨折方向縱向包埋后制作成5μm層厚的縱向組織切片。（3）組織學(xué)觀察：將制作好的石蠟切片脫蠟脫水，蘇木紫-伊紅染色（HE）行脫水、封片后用顯微鏡觀察。（4）免疫組織化學(xué)染色：將蠟塊切成4μm厚的切片貼在載玻片上，常規(guī)脫蠟脫水后加入VEGF單克隆抗體（抗體稀釋度為1：2000），SABC染色后用顯微鏡觀察新生血管情況。（5）VEGF表達(dá)水平測定：首先將骨痂置入乳缽中，加生理鹽水進(jìn)行研磨，離心后取上層清液，將上層清液用蒸餾水稀釋100倍制得標(biāo)本溶液。滴加1ml蒸餾水置標(biāo)準(zhǔn)品溶液中（濃度為8000pg/ml），然后將其裝在8個試管中，每個試管中再加入300μl稀釋后的標(biāo)本溶液，然后1號管中加入300μl濃度為8000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后從1號管中吸出300μl加入2號管，然后再從2號管中吸出300μl加入3號管，依次類推，其中7號管中吸出300μl廢棄掉，8號管作為對照管。檢測每管的光密度，從而計算出血管中VEGF的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 D7：對照組骨折斷端有少量的成纖維細(xì)胞，成骨樣細(xì)胞形成，但伴有明顯的骨膜反應(yīng)。觀察組成骨樣細(xì)胞量遠(yuǎn)大于對照組，肉芽組織大量形成，骨膜反應(yīng)較輕。D14：對照組骨折間隙可見軟骨內(nèi)成骨現(xiàn)象。觀察組中骨折間隙軟骨內(nèi)成骨明顯，有較多成熟軟骨細(xì)胞，并伴有新生管形成。D21：對照組骨折處成骨細(xì)胞增殖，軟骨細(xì)胞呈肥大樣，部分呈現(xiàn)鈣化樣。觀察組骨折處出現(xiàn)較多成熟板層骨，伴有成熟的骨小梁生成即開始骨痂塑型期。D28：對照組骨折處出現(xiàn)部分成熟板層骨，觀察組形成大量成熟板層骨，基本完成骨痂塑性。

2.2 免疫組織化學(xué)染色新生血管生成情況 （1）顯微鏡下觀察：D7：對照組骨痂處幾乎無著色的棕色細(xì)胞顆粒，觀察組骨痂周圍見棕色細(xì)胞，但兩組均未見新生血管形成。D14：對照組骨痂處有少量著色的棕色細(xì)胞顆粒，觀察組骨痂周圍著色的棕色細(xì)胞由外向內(nèi)逐漸減少，可見少量血管芽和血管腔形成。D21：對照組骨痂周圍著色的棕色細(xì)胞由外向內(nèi)逐漸減少，也可見少量血管芽和血管腔形成，觀察組僅骨痂深處有棕色顆粒，并有大量血管芽、血管腔形成。D28：對照組骨痂僅有少量棕色細(xì)胞顆粒，小血管腔逐漸形成，觀察組中血管腔擴大，血管數(shù)量大量增加。（2）新生血管計數(shù)結(jié)果：D7兩組均未見新生血管形成。D14對照組新生血管量為0，觀察組為（14.46±2.68），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。D21對照組新生血管量為（12.63±2.21），觀察組為（17.10±2.53），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。D28對照組新生血管量為（28.39±4.52），觀察組為（42.32±5.82），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 VEGF表達(dá)水平測定 術(shù)后D7、D14、D21、D28 4個時間段觀察組VEGF表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 術(shù)后兩組各時間點VEGF表達(dá)量（pg/ml）

3 討論

骨折愈合是一個極其復(fù)雜且緩慢的過程，期間受到多種因子及激素的調(diào)控，其中內(nèi)固定、生長因子及血流量的供給仍是關(guān)鍵的不可或缺因素［5-6］。國內(nèi)外大量的研究表明，生物因子在骨折愈合過程中起到了重要作用。多種動物骨折模型及兔的骨質(zhì)延長術(shù)中多次使用局部注射bFGF［7-9］。有研究表明，大鼠全身注射bFGF可以刺激皮質(zhì)骨 、松質(zhì)骨的形成［10］。而本文主要是研究bFGF對骨折處VEGF合成的影響，主要深入探討bFGF對VEGF表達(dá)影響。

本研究組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，術(shù)后D14開始觀察組中骨折間隙軟骨內(nèi)成骨明顯，有較多成熟軟骨細(xì)胞，并伴有新生管形成。免疫組化染色結(jié)果顯示，術(shù)后D14開始觀察組骨痂周圍著色的棕色細(xì)胞由外向內(nèi)逐漸減少，可見少量血管芽和血管腔形成，而對照組術(shù)后D21開始形成少量血管芽和血管腔。新生血管計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示觀察組D14開始出現(xiàn)新生血管，而對照組D21開始出現(xiàn)新生血管，比觀察組延遲了7d，而且D14、D21、D28 3個階段觀察組新生血管量均顯著高于對照組。術(shù)后D7、D14、D21、D28 4個時間段觀察組VEGF表達(dá)量均高于對照組，且對照組VEGF定量水平峰值與觀察組之間間隔7d。有研究表明bFGF內(nèi)皮細(xì)胞強有力的有絲分裂原，體內(nèi)體外均可促進(jìn)血管生成［11］，當(dāng)骨折處缺血時，bFGF分泌促進(jìn)VEGF分泌，兩者協(xié)同共同作用于骨折處，改善其缺血情況，促進(jìn)骨折愈合過程。

綜上所述，骨折處局部注射bFGF可以增加骨折愈合過程中VEGF表達(dá)量，并延長其表達(dá)時限，兩者共同作用可以促進(jìn)骨折愈合過程。