孫吉 張坤馳

摘 要：隨著高通量測(cè)序技術(shù)的日漸成熟，技術(shù)原理和材料工程不斷創(chuàng)新，基礎(chǔ)科研在臨床診療中的應(yīng)用日趨廣泛，NGS在癌癥基因組學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。最近，NGS已被用于臨床腫瘤學(xué)以促進(jìn)癌癥的個(gè)體化治療。本文列舉了高通量測(cè)序技術(shù)在臨床上的腫瘤診斷、治療及預(yù)后方面的主要指導(dǎo)作用，并展望了其在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；腫瘤；診治；預(yù)后

1 NGS的簡(jiǎn)介

高通量測(cè)序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）是近年來(lái)發(fā)展成熟的一項(xiàng)前沿技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。[1] NGS是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，通常包括樣本前處理、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析解讀等，所以也被稱為深度測(cè)序（Deep Sequencing）。[2]

2 NGS的主要平臺(tái)

測(cè)序技術(shù)包括多種方法，基本的原理都是在DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)，借助一些化學(xué)標(biāo)志物在堿基插入DNA 鏈時(shí)發(fā)出的信號(hào)來(lái)讀取序列信息。大體上它們可被組合為模板制備、測(cè)序和成像以及數(shù)據(jù)分析，可以通過特定方法的獨(dú)特組合將不同的平臺(tái)區(qū)分開，并從每個(gè)平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)確定其種類。而各平臺(tái)有其不同的原理、優(yōu)點(diǎn)及局限性，如Illumina/Solexa 平臺(tái)應(yīng)用可逆鏈終止物和合成測(cè)序法，其價(jià)格低廉且通量高數(shù)據(jù)量大，局限是儀器和用于分析的費(fèi)用高昂；Life/Solid平臺(tái)應(yīng)用連接測(cè)序法，準(zhǔn)確度高、成本低，不過讀長(zhǎng)短、測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)；Roche/454平臺(tái)應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法，準(zhǔn)確度達(dá)99%以上，在第二代中具有最高讀長(zhǎng)并且比第一代的測(cè)序通量大，但無(wú)法測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度；Ion Torrent平臺(tái)應(yīng)用半導(dǎo)體技術(shù)，直接在化學(xué)和數(shù)學(xué)信息之間建立聯(lián)系，具有低成本、快速并準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。[3]

3 NGS在臨床腫瘤診斷、治療及預(yù)后方面的應(yīng)用

3.1 在乳腺癌和卵巢癌方面的應(yīng)用

NGS用于24個(gè)三陰性乳腺癌（TNBC）與14個(gè)臨近正常組織獲得的公開可用的小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，重繪不同類型的sncRNAs，發(fā)現(xiàn)TNBC中有55個(gè)miRNA異常表達(dá)，結(jié)果多于繼往的研究，為于TNBC的診斷開發(fā)了新的工具；有研究將NGS平臺(tái)用于臨床難治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌（mBC），將315個(gè)外顯子和28個(gè)難治性mBC基因的選擇性內(nèi)含子測(cè)序，使用這種定向的NGS選定分析潛在的可控轉(zhuǎn)變來(lái)描述晚期癌癥患者的突變，該實(shí)驗(yàn)分析為35%的臨床患者提供了幫助；有研究調(diào)查了287名連續(xù)不相關(guān)的意大利婦女受乳腺癌或卵巢癌的影響，利用可靠的拷貝數(shù)變異（CNV）預(yù)測(cè)算法進(jìn)行NGS輸送，所有樣品用多重?cái)U(kuò)增子定量（MAQ）分析，而多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)作為可能的替代方法，結(jié)果表明BRCA1/2基因的重新排列的prevalence是患者中檢測(cè)到的所有治病突變的12%，MAQ的結(jié)果顯示假陽(yáng)性結(jié)果的2.8%，這種基于NGS的方法完全可以滿足BRCA1/2 LGRs檢測(cè)的靈敏性和特異性需求，這種方式是非常易于使用的BRCA1/2篩查方法，并較易在門診檢驗(yàn)中使用。[4]

3.2 在癌癥免疫治療上的應(yīng)用

腫瘤基因突變對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起有很大影響。2012發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞依賴的癌癥進(jìn)展機(jī)制，使得癌癥與免疫治療具備潛在關(guān)聯(lián)。NGS可以應(yīng)用于個(gè)體化腫瘤臨床治療，可包括個(gè)體化的劑量、疫苗開發(fā)、基因突變的對(duì)癥治療。比如，腫瘤活性淋巴細(xì)胞的新抗原和有效遷移的連續(xù)識(shí)別，促進(jìn)免疫治療的發(fā)展。[5]

近年來(lái)，計(jì)算機(jī)分析能力的開發(fā)，NGS數(shù)據(jù)可有效分析腫瘤-免疫細(xì)胞相互作用，如Tlminer方法可以整合免疫原分析，包括：人類白細(xì)胞抗原分型、新抗原預(yù)測(cè)、免疫浸潤(rùn)特征和腫瘤免疫原性的定量，[6]從小基因集中準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體腫瘤的總突變量（PTML），這種方法已經(jīng)被應(yīng)用于指導(dǎo)靶向治療。

4 結(jié)論

NGS具有許多優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、成本低 、覆蓋面廣以及產(chǎn)出巨大等特點(diǎn)，[7]能夠在一個(gè)單一的測(cè)試中以相對(duì)低的成本完全測(cè)序所有類型的突變（數(shù)百到數(shù)千個(gè)）的所有類型的突變以及與其他測(cè)序方式相比的靈敏度、速度。其中對(duì)海量的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，精準(zhǔn)鎖定相關(guān)突變是NGS的難點(diǎn)，需要進(jìn)一步的成熟完善。雖然NGS已被用于臨床實(shí)踐，NGS可以提供重要的信息來(lái)表征癌癥基因組結(jié)構(gòu)的變化，然而，在對(duì)疾病全面的認(rèn)識(shí)中，表觀遺傳變異、腫瘤微環(huán)境的貢獻(xiàn)和種系遺傳變異也需要列入考慮范圍。

參考文獻(xiàn)：

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[3]趙躍.下一代半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)在遺傳性心肌病分子診斷中的應(yīng)用.遺傳，2015（7）.

[4]Concolino P，Rizza R，Mignone F，et al.A comprehensive BRCA1/2 NGS pipeline for an immediate Copy Number Variation （CNV） detection in breast and ovarian cancer molecular diagnosis[J].Clinica Chimica Acta，2018，480.

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