邵華榮，房紹英，吳季栩，劉 飛，馬 河，凌沛學，程艷玲

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

多糖口服具有抗疲勞、抗抑郁、保肝、抗瘧疾、調(diào)血脂、提高免疫力等藥理活性[1-4]。本課題組前期研究證實，人參多糖口服可提高免疫力，貽貝多糖口服具有顯著調(diào)血脂活性，但藥動學研究發(fā)現(xiàn)，兩者口服原型多糖生物利用度極低。深入探索多糖類藥物口服生物利用度低與其良好活性之間的關(guān)聯(lián)，應首先對多糖口服后的轉(zhuǎn)運過程進行研究。大鼠原位單向腸灌流模型，是研究藥物吸收代謝的重要模型之一[5-7]，我們采用此模型對人參多糖與貽貝多糖口服后在腸道內(nèi)的降解進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

AUW-120D電子分析天平，LC-20AT高效液相色譜儀，RID-20AT示差折光檢測器（日本島津）；高速微量冷凍離心機（美國賽默飛世爾）；加比士C6T微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學儀器公司）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器公司）。

1.2 試藥

貽貝多糖（山東省藥學科學院自制，批號20160501）；人參多糖（山東省藥學科學院自制，批號20161222）；無水氯化鈣，葡萄糖，NaCl，KCl，NaHCO3，NaH2PO4，MgCl2，均為國產(chǎn)分析純。Krebs-Ringer緩沖液為灌流液（簡稱K-R試液），其組成為：NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl23.3 mmol/L，NaH2PO42.67 mmol/L，MgCl20.21 mmol/L，NaHCO316.3 mmol/L，D-葡萄糖7.8 mmol/L。

1.3 動物

SD大鼠12只，體重范圍190～210 g，雌雄各半，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。飼養(yǎng)條件：SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，每籠5只，室溫19～26 ℃，濕度40 %～70 %，日溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h，試驗前適應飼養(yǎng)7 d。實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2014 0008。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

兩種多糖含量均采用HPLC-示差折光檢測器進行分析。

貽貝多糖分析條件：色譜柱型號TSK-GEL G5000PWXL，流動相為0.05 mol/L 硝酸鈉溶液，流速0.5 ml/min，柱溫40 ℃，檢測器溫度35 ℃，進樣量20 μl。貽貝多糖相對保留時間約11.7 min，線性關(guān)系良好（r=0.9992），線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，RSD≤6.22 %，回收率為96.58 %～107.41 %。

人參多糖分析條件：TSK-GEL G3000PWXL，流動相為0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液，流速：0.6 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測器溫度40 ℃。人參多糖相對保留時間約11.8 min，線性關(guān)系良好（r=0.9986），線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，RSD≤5.78 %，回收率為90.60 %～111.22 %。

2.2 大鼠原位腸灌流試驗

取12只SD大鼠，其中貽貝多糖及人參多糖灌流組各6只，雌雄各半，試驗前禁食12 h以上，自由飲水，腹腔注射1 %戊巴比妥溶液40 mg/kg，麻醉后固定，沿腹中線剖開腹部，分別小心分離選取待考察腸段（十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），并于兩端切小口，以37 ℃生理鹽水沖凈腸腔后插管并用手術(shù)線結(jié)扎，管路進出口處于同一高度， 傷口用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕并用手術(shù)燈照射保持體溫[5]。腸段劃分方法：十二指腸段為距幽門1 cm處起；空腸段為距幽門15 cm處起；回腸段為盲腸部位上行20 cm處起；結(jié)腸段為緊鄰盲腸后端起至直腸，各段均取10 cm左右。

各腸段先用一定濃度的多糖灌流液以0.2 mL/min流速灌流20 min后，保持流速不變，改用已稱重裝有多糖溶液的注射器進行腸灌流，同時出口處用已稱重的接液瓶接收灌流液，以首滴接收液滴下算起，收集15 min的接收液，將接液瓶稱重并記錄。采用質(zhì)量法校正腸內(nèi)水分吸收引起的灌流液體積的變化，計算泵入供試液體積Vin=min/ρin（泵入腸內(nèi)供試液質(zhì)量min，測定密度為ρin），接收液體積Vout=mout/ρout（接收到的灌流液質(zhì)量mout，測定密度為ρout），Vin與Vout的差異即是腸道吸收或分泌的水分的體積。供試液及接受液內(nèi)多糖測定按2.1項方法進行。處死大鼠，輕柔剪下被考察腸段，以手術(shù)線附著法測量長度（l）和周長，計算內(nèi)徑（r）。

按以下公式計算藥物的降解速率常數(shù)（Ka）及降解百分率（P%）[5]。

公式中，v為灌流速度（ml/min），Cin、Cout為供試液及接收液的多糖藥物濃度（mg/L），l和r為灌流腸段的長度（cm）和半徑（cm）。

2.3 貽貝多糖在不同腸段的降解

10 mg/ml貽貝多糖在各腸段的降解情況見表1。由表1可見，十二指腸段各接收液樣本均未見貽貝多糖色譜峰，表明貽貝多糖在十二指腸可全部被降解，在空腸段的降解百分率為40.33 %±15.65 %，在回腸和結(jié)腸部位，貽貝多糖降解百分率較低，分別為0.70 %±0.49 %和0.30 %±0.14 %，表明大分子貽貝多糖原型在回腸和結(jié)腸較難吸收或降解。

表1 各腸段對貽貝多糖的降解

2.4 人參多糖在不同腸段的降解

6 mg/ml人參多糖在各腸段的降解情況見表2。人參多糖在各腸段均有不同程度的降解，其中，回腸部位的降解百分率較大，為52.41 %±13.14 %，結(jié)腸部位降解較少，僅為0.68 %±0.54 %。十二指腸和空腸部位的降解百分率分別為25.19 %±17.02 %和33.04 %±15.26 %。

表2 各腸段對人參多糖的吸收

3 討論

本研究采用HPLC結(jié)合示差折光檢測器，分別建立了測定大鼠腸灌流液中貽貝多糖和人參多糖原型含量的方法，該法線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，回收率和精密度良好，可用于兩種多糖類藥物大鼠在體腸灌流試驗研究。

本課題組前期藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，貽貝多糖口服及人參多糖口服并未在血漿中檢測到多糖原型，而本研究發(fā)現(xiàn)兩種多糖在腸灌流流出液中含量均大幅降低，因此，推測兩種多糖是在腸道內(nèi)發(fā)生了降解。相比于采用模擬腸液進行多糖體外降解試驗，大鼠原位在體腸灌流模型可全面地包含腸內(nèi)多糖降解酶，更為科學合理。

貽貝多糖在十二指腸段的降解百分率為100 %，這可能是因為貽貝多糖（Mr1.20×106）主鏈中含α 1→4糖苷鍵，為胰淀粉酶的作用靶點，因此，推測貽貝多糖口服發(fā)揮調(diào)血脂活性的可能是其寡糖。人參多糖（Mr2.9×104）在各腸段均存在部分降解，在回腸內(nèi)的降解百分率最大，約52 %，說明人參多糖調(diào)節(jié)機體免疫的作用可能是其寡糖和部分多糖。由此也證實，在多糖口服活性與作用機制研究中，將多糖直接加入體外細胞培養(yǎng)體系中進行的相關(guān)研究，與多糖類藥物口服后的體內(nèi)作用途徑相差甚遠[8]。

兩種多糖類藥物降解形成的寡糖是否可被吸收尚需進一步研究，而另一方面，腸道菌群可能是多糖及其寡糖作用的腸內(nèi)靶點。近年，腸道菌群與機體免疫及各種慢性疾病之間的關(guān)系得到充分證實[9-10]，而多糖和寡糖作為腸道菌群的底物，可能對菌群的定植和代謝起到非常重要的作用。將多糖消化道轉(zhuǎn)運過程與其對腸道菌群的影響相結(jié)合，對闡明多糖口服的作用途徑具有重要意義。