劉效栓，李喜香，李季文，畢映燕，錢夢(mèng)茹

甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050

五福飲口服液原方出自張仲景《景岳全書·新方八陣》卷五十一方之五福飲，由人參、當(dāng)歸、熟地黃、炒白術(shù)、炙甘草等5味藥物組成，主治五臟氣血虧損，在防治人類亞健康方面有較大開(kāi)發(fā)前景。本研究擬將傳統(tǒng)五福飲湯劑制備成五福飲口服液，通過(guò)單因素試驗(yàn)及中心組合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)五福飲口服液的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳提取工藝參數(shù)，為防治亞健康的五福飲口服液保健品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UV1800型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（SHIMADZU）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平AR522CN、AR124CN（上海奧豪斯儀器有限公司）；鼓風(fēng)式干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試藥 人參、當(dāng)歸、熟地黃、炒白術(shù)、炙甘草飲片（甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部提供）；人參皂苷Re（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20140901）；D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20140715）；95%乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；無(wú)水乙醇、濃硫酸、冰乙酸、高氯酸（天津百世化工有限公司）；試驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

按處方量（人參12.0 g，當(dāng)歸18.0 g，熟地黃18.0 g，炒白術(shù) 9.0 g，炙甘草 6.0 g）稱取藥材，以浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，加水回流提取，過(guò)濾，收集合并濾液，將濾液濃縮至一定量，測(cè)定干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量。

2.1 干膏得率測(cè)定方法 取蒸發(fā)皿干燥恒重，將10 mL濃縮液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于烘箱（105℃）中烘3小時(shí)后取出，轉(zhuǎn)移至干燥器中，放置恒溫，稱重［1-4］。干膏得率（g/g）=（10 mL 濃縮藥液干燥后所得干膏量×10）/63。

2.2 總多糖含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取D-無(wú)水葡萄糖適量，精密稱定，配制成每毫升含0.100 0 mg溶液，精密量取50 μL該溶液至50 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 量取濃縮藥液10 mL，加入95%乙醇溶液，使體系含醇量達(dá)到60%，置于-4℃冰箱內(nèi)，冷藏醇沉，24小時(shí)后取出抽濾，烘干。將全部沉淀溶解至25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容搖勻，備用。量取上述溶液0.1 mL，稀釋至10 mL，即為供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液 200、400、600、800、1 000 μL 于 6 支干燥具塞試管中，不足1 mL者加蒸餾水補(bǔ)足1 mL，依次加入6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15分鐘后取出立即放入冰水浴10分鐘后取出，室溫放置15分鐘，照中國(guó)藥典Ⅰ部附錄V A紫外-可見(jiàn)分光光度法，于485 nm處測(cè)定吸光度（A）值，以A值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程：

2.2.4 方法學(xué)考察 考察該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率，其RSD分別為1.50%、1.78%、0.95%、1.13%，說(shuō)明方法可行。

2.2.5 樣品的測(cè)定 量取供試品溶液1.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，室溫放置15分鐘，于485 nm處測(cè)定吸光度（A）值。將吸光度（A）值代入回歸方程計(jì)算得樣品中總多糖含量［5-8］。

2.3 總皂苷含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取人參皂苷Re適量，精密稱定，配制成每毫升含0.004 0 mg溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 量取5 mL濃縮藥液，加入無(wú)水乙醚萃取3次，20 mL/次，棄乙醚層，水層加水飽和的正丁醇萃取3次，30 mL/次，合并正丁醇層，并以適量濃氨水將正丁醇層洗滌2次，將洗滌后的正丁醇層溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸干溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取 50、100、200、300、400、500 μL人參皂苷Re對(duì)照品溶液（濃度為0.0040 mg/mL）分別置于6支干燥具塞試管中，揮干溶劑后加入0.5 mL 0.2%香草醛-高氯酸溶液，混合均勻后，置于60℃恒溫水浴15分鐘，取出立即用冰水冷卻2分鐘，加入77%硫酸溶液5 mL，取出放置至室溫，消除汽泡后照紫外可見(jiàn)分光光度法，于535 nm處測(cè)定吸光度，并以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.001X+0.115（R=0.999）。

2.3.4 方法學(xué)考察 考察該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率，其 RSD 分別為 1.25%、1.39%、1.90%、1.26%，說(shuō)明方法可行。

2.3.5 樣品的測(cè)定 精密吸取樣品溶液100μL，置于100mL具塞試管中，后續(xù)處理方法與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)操作相同，照中國(guó)藥典Ⅰ部附錄VA紫外-可見(jiàn)分光光度法，于535 nm處測(cè)定吸光度（A）值。將吸光度（A）值代入回歸方程計(jì)算得樣品中總皂苷含量［9-12］。

2.4 提取工藝的單因素試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［13］、［14］、［15］確定浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)、加水量為五福飲口服液提取工藝的影響因素。本試驗(yàn)按處方量（人參12.0 g，當(dāng)歸18.0 g，熟地黃18.0g，炒白術(shù)9 g，炙甘草6.0 g）稱取藥材，以浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取時(shí)間次數(shù)為考察因素，加水回流提取，過(guò)濾，收集合并濾液，將濾液濃縮至一定量，測(cè)定干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量。從而初步確定各因素水平。

2.4.1 浸泡時(shí)間 按處方量稱取藥材4份，分別加入630 mL水（10 倍），置于圓底燒瓶中，分別浸泡 0、15、30、60 分鐘，回流提取1小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，濾液濃縮至 100 mL。按照“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下操作方法測(cè)定干膏得率、總多糖、總皂苷含量。結(jié)果可見(jiàn)，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，各指標(biāo)含量呈上升趨勢(shì)，浸泡至60分鐘含量最高，但與30分鐘時(shí)含量相差較小，綜合考慮時(shí)間成本與各指標(biāo)成分的提取量，確定浸泡時(shí)間為30分鐘，見(jiàn)表1。

表1 不同浸泡時(shí)間各指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果

2.4.2 提取時(shí)間 稱取處方量藥材4份，編號(hào)1-4，置于圓底燒瓶中，分別加入630 mL水（10倍），浸泡30分鐘后，1-4號(hào)分別回流提取0.5，1，2，3小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，濾液濃縮至100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下操作方法測(cè)定干膏、總多糖、總皂苷含量，結(jié)果可知，提取1、2、3小時(shí)的各指標(biāo)含量較提取0.5小時(shí)含量高，但互相之間差異不大，因此提取時(shí)間需由進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)確定，見(jiàn)表2。

表2 不同提取時(shí)間各指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果

2.4.3 提取次數(shù) 稱取處方量藥材1份，編號(hào)1-4，每份含人參 12.0g，熟地黃 18.0g，當(dāng)歸 18.0g，炒白術(shù)9.0 g，炙甘草6.0 g，置于圓底燒瓶中，浸泡30分鐘后，回濾液流提取，每次所得濾液?jiǎn)为?dú)收集，第1次提取結(jié)束，過(guò)濾后加入630 mL水（10倍）提取第2次，以此類推，共提取4次，過(guò)濾，分別收集每次濾液，均濃縮至100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下操作方法測(cè)定干膏、總多糖、總皂苷含量，結(jié)果可知，第4次提取所得干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量?jī)H占4次總量的2.58%，5.56%，2.71%，可知經(jīng) 2 次提取后，各指標(biāo)含量提取量在90%以上，可認(rèn)為已提取完全，故將提取次數(shù)確定為2次，見(jiàn)表3。

表3 不同提取次數(shù)各指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果

2.4.4 加水量 稱取處方量藥材4份，置于圓底燒瓶中，分別加入相當(dāng)于藥材重（61 g）8、10、12、14倍的水，煎煮3次，2 h/次。合并煎煮液，濃縮至 100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下操作方法測(cè)定干膏、總多糖、總皂苷含量。結(jié)果可知，在加水量的試驗(yàn)中，除8倍溶劑所得干膏、總多糖、總皂苷的含量較低外，其余10、12、14倍溶劑評(píng)價(jià)指標(biāo)含量相差不大，需由進(jìn)一步試驗(yàn)確定，見(jiàn)表4。

表4 不同加水量各指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果

2.5 提取工藝的優(yōu)化

2.5.1 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由以上數(shù)據(jù)及圖表分析，確定試驗(yàn)浸泡時(shí)間為30分鐘、提取次數(shù)為2次，并選定各影響因素的水平。由于單因素試驗(yàn)研究難以反映多個(gè)因素之間相互作用對(duì)提取工藝的影響，因此需要結(jié)合中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間、加水量進(jìn)行進(jìn)一步考察，再根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)得出的結(jié)果綜合分析確定。故研究擬采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［16-18］，以干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，考察提取時(shí)間、加水量等因素，因素水平見(jiàn)表5。

表5 五福飲口服液提取工藝因素-水平

2.5.2 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 按照“2.5.1”項(xiàng)下方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表6。以Design-Expert 8.05 b軟件分析，所得方差分析結(jié)果見(jiàn)表7，響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖1—2。

表6 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表7 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析

圖1 提取時(shí)間和料液比對(duì)綜合評(píng)分的等高線

圖2 提取時(shí)間和料液比對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面

由表7可以看出，該模型失擬項(xiàng)顯著（P＜0.05），決定系數(shù)（P＞0.05）不顯著，證明該模型擬合度和可信度較好。另外，因素A、A2、B2對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果影響顯著，因素B和交互項(xiàng)AB影響不顯著，說(shuō)明該模型可用于五福飲口服液提取工藝的優(yōu)化。

利用響應(yīng)面和等高線分析各因素的相互作用，等高線密度大說(shuō)明影響因素對(duì)響應(yīng)值貢獻(xiàn)大。并且等高線的形狀可直觀看出交互效應(yīng)的大小，橢圓形反映了兩因素交互作用較強(qiáng)，呈圓形則相反，而響應(yīng)曲線較陡說(shuō)明交互作用較強(qiáng)。從圖1可看出等高線呈橢圓形，說(shuō)明影響因素提取時(shí)間（A）與料液比（B）交互作用較明顯。響應(yīng)面圖可知該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

利用Point Prediction進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，獲得一組響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件：提取時(shí)間A為136.3分鐘，料液比為10.79，在此優(yōu)化條件下，R為0.831。根據(jù)得到的最優(yōu)條件，并且考慮到實(shí)際操作的可行性，將五福飲口服液的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為：浸泡30分鐘，提取2次，提取時(shí)間A為120分鐘，料液比B為11倍，在此條件下提取，依法計(jì)算綜合評(píng)分值，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行3批驗(yàn)證，綜合評(píng)分結(jié)果為0.828（n=3）。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間偏差較小，說(shuō)明二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型所得到的優(yōu)化條件符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型可靠且重現(xiàn)性良好。

2.6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法的預(yù)測(cè)結(jié)果，同法做3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，綜合評(píng)分的平均值為0.828，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值較為接近，該方法可用于五福飲口服液的提取，見(jiàn)表8。

表8 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法是將中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析后，描繪出響應(yīng)-考察因素曲面圖，預(yù)測(cè)模型一般是一個(gè)連續(xù)的曲面。從響應(yīng)曲面上選擇最優(yōu)的響應(yīng)區(qū)，確定自變量的取值范圍，即可確定最佳試驗(yàn)條件，其優(yōu)勢(shì)是在試驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)自變量的各個(gè)水平進(jìn)行分析［19］。該方法所采用的模型為非線性數(shù)學(xué)模型，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以此提高試驗(yàn)精度，試驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測(cè)性良好、可信度較高。

本試驗(yàn)研究了五福飲口服液的提取工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)選取2個(gè)影響因素，建立影響因素與響應(yīng)值（干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量三者的綜合評(píng)分為響應(yīng)值）相互作用的數(shù)學(xué)模型，繪制響應(yīng)曲面圖，通過(guò)建立目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程，預(yù)測(cè)最佳提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果與函數(shù)預(yù)測(cè)值一致。