魏玉嬌，何 玲，郭小榮，曹林忠 ，張虎林 ，張曉剛，郭成龍△

1甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2甘肅中醫(yī)藥大學

激素性股骨頭壞死是使用激素最嚴重的并發(fā)癥之一，發(fā)病率高、致殘率高，臨床治療手段有限，給患者心理、經(jīng)濟帶來壓力［1］。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，髓芯減壓聯(lián)合生骨再造丸對早期激素性股骨頭壞死療效明顯［2］。本研究通過觀察骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表達的變化，進一步探討生骨再造丸對激素性股骨頭壞死的防治機理。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年雄性青紫藍兔60只，體質(zhì)量（2.0±0.20）kg，清潔等級二級，由甘肅省生物制品研究所實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（甘）2015-0001，標準顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物 生骨再造丸由黃芪、淫羊藿、骨碎補、血竭、三七等藥物組成（甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院純中藥制劑，批號：151207）；大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，美國Sigma公司，進口藥品注冊證號：H20040139，批號：LL0411，規(guī)格：25 mg/ 瓶）；甲強龍（美國輝瑞生物制藥公司，批號：F4088306）；青霉素（80萬U，哈藥集團制藥總廠，批號：F40088305）。

1.3 試劑 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、戊巴比妥鈉、乙二胺四乙酸二鈉由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨研所提供，均購自天津華生試劑有限公司。

1.4 儀器 ZT-12J1型生物組織自動脫水機（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）；OLYMPUS VANOX型自動光學顯微鏡（JAPAN）；OLYMPUS型生化儀（日本，LC-005）；202-ZAB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；總RNA提取試劑盒Ⅱ（美國 OMEGA 公司，批號：R6934）；TIANScript cDNA型第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：RT120420）；PCR 引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司）；2×Taq PCR Master Mix 型（天根生化科技有限公司，批號：KT201-02）；50bp DNA Ladder Marker（北京博凌科為生物科技有限公司，批號：M07-01）。

1.5 方法

1.5.1 動物分組 60只青紫蘭兔適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為5組，即N組：正常對照組（8只）；Y組：模型對照組，M組：生骨再造丸組，S組：手術(shù)組，SM組：綜合治療組，每組13只。

1.5.2 動物造模 兔子耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，Sigma 公司產(chǎn)品）50 μg/kg 共 2 次，每次間隔24小時，最后1次注射LPS后臀肌注射甲基強的松龍（MP，20 mg/kg）共3次，每次間隔24小時。4周后模型成立。

1.5.3 給藥及飼養(yǎng) 模型成立后第2天開始灌胃，灌胃劑量按照人與家兔體表面積折算的等效劑量比例換算，生骨再造丸配制成每毫升所含生藥相當于3 g原藥材的濃縮液，M組、SM組給藥劑量4.6 mL/（kg·d），連續(xù)灌胃 8周。N 組和 Y 組予等量［4.6 mL/（kg·d）］生理鹽水連續(xù)灌胃 8周。單籠標準兔子顆粒飼料喂養(yǎng)（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗中心提供），自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風，控制室溫在（22±1）℃，光照與黑暗時間為每12小時交替。

1.5.4 手術(shù)方法 手術(shù)組采用髓芯減壓術(shù)治療。動物俯臥于手術(shù)臺上，局部備皮后消毒，沿大轉(zhuǎn)子切開皮膚、皮下，分離肌肉及骨膜，在大轉(zhuǎn)子上用2 mm細鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆孔，以不越過股骨頭軟骨面為界。徹底清除髓腔后關閉切口，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素10萬U以預防感染，1次/d，共1周。

1.5.5 取材與處理 第11周采用靜脈推注空氣法處死家兔，觀察大體標本。然后完整無損地切取雙側(cè)股骨頭，將雙側(cè)股骨頭沿正中冠狀面剖開，4%多聚甲醛液固定，10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）脫鈣，系列酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細胞、髓腔脂肪細胞變化，計數(shù)空骨陷窩，計算空骨陷窩率。

1.5.6 BM P-2與V EG F m RN A表達的檢測 清除股骨頭表面組織，沿基底部將股骨頭鋸下后沿矢狀面剖開，取骨組織50 mg，按試劑盒說明書提取總RNA，用微量核酸蛋白分析儀計算所提RNA含量和純度。取總RNA 2μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，β-actin 上游引物：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′；BMP-2 上游引物：5′-GTCCTGAGCGAGTTCGAGTT-3′，下游引物：5′-TGAAGCTCTGCTGAGGTCAT-3′；VEGF 上游引物：5′-AGGAGACAATAAACCCCACG-3′，下游引物：5′-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3′。

β-actin、BMP-2、VEGF 的 PCR 擴增產(chǎn)物大小分別為：375bp、308bp、187bp。PCR 擴增條件（25 μL體系）：94℃預變性2分鐘；95℃變性30 s，退火溫度30 s（β-actin 55℃、TGF-β154℃、CTGF 56℃）72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸5分鐘，4℃冷卻5分鐘。對PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統(tǒng)測定灰度值，以β-actin mRNA表達作為內(nèi)參照，以BMP-2 mRNA和VEGF mRNA值與β-actin mRNA的灰度比值表示mRNA相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 N組動物精神飲食活動正常，無死亡。造模各組在臀肌注射甲基強的松龍（MP）后出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍、皮毛失去光澤、體毛干枯脫落、皮下脂肪減少、大便溏薄等表現(xiàn)。至第3周時上述表現(xiàn)逐漸消失，動物體質(zhì)量無明顯變化，精神狀態(tài)及活動良好。

2.2 股骨頭標本觀察 各組股骨頭標本外形大體正常，關節(jié)軟骨變薄、略蒼白色，未見明顯軟骨剝脫或股骨頭塌陷。HE染色Y組骨小梁排列散亂、稀疏、部分骨小梁萎縮、斷裂，周圍無成骨細胞，骨髓內(nèi)造血細胞和脂肪細胞壞死，骨髓腔擴大。M組骨髓內(nèi)血管擴張，骨小梁稍細，結(jié)構(gòu)基本完整，骨小梁周圍偶見少量成骨細胞，空骨陷窩較Y組減少，脂肪細胞較多，造血細胞較多，骨髓細胞分布不均勻。S組骨小梁變細，結(jié)構(gòu)基本完整，形態(tài)不規(guī)則、骨髓內(nèi)大面積造血細胞和脂肪細胞壞死，壞死周圍可見炎性細胞浸潤及纖維組織增生。SM組骨小梁粗大、結(jié)構(gòu)基本完整，骨小梁周圍可見大量成排骨母細胞，脂肪細胞少，軟骨下骨細胞飽滿、空陷窩少，可見大量造血細胞，骨髓細胞分布均勻。M組、S組、SM組骨小梁較Y組密集，脂肪細胞逐次減少，造血細胞增多，有利于骨壞死的修復，其中S組和SM組尤為明顯。與Y組比較，各治療組空陷窩率均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以MS組降低最為顯著（P＜0.01），見圖1—4及表1。

圖1 模型對照組（Y組，×400）

圖2 生骨再造丸組（M組，×400）

圖3 手術(shù)組（S組，×400）

圖4 綜合治療組（SM組，×400）

表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較（±s） %

表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較（±s） %

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 只數(shù) 空陷窩率模型對照組 12 24.34±3.52生骨再造丸組 12 17.32±2.51*手術(shù)組 12 19.68±1.75*綜合治療組 12 14.30±2.06**

2.3 各組兔股骨頭骨組織中BM P-2及V EG Fm RN A表達 與Y組比較，各治療組BMP-2和VEGF mRNA表達升高，其中M及MS組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以MS組BMP-2及 VEGFmRNA水平升高最為顯著（P＜0.01），見表 2。

表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達比較（±s）

表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達比較（±s）

注：與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 只數(shù) BM P-2 V EG F模型對照組 12 0.22±0.02 0.36±0.04生骨再造丸組 12 0.42±0.05** 0.58±0.04*手術(shù)組 12 0.28±0.05 0.44±0.07綜合治療組 12 0.49±0.06** 0.76±0.08**

3 討論

激素性股骨頭壞死是一種應用激素后造成的以無菌性骨壞死為特征的疾病，是無創(chuàng)性股骨頭壞死的首要原因，然而，目前針對激素性股骨頭壞死的現(xiàn)有臨床治療方案收效甚微［3］。激素性股骨頭壞死屬祖國醫(yī)學“骨蝕”“痹癥”“骨痹”“髖骨痹”“骨蔞”等范疇［4］。該病的發(fā)生與先天不足、后天失養(yǎng)、外傷等因素密切相關［5］。臨床對該病的認識雖各有側(cè)重，但不外乎虛、痰、瘀3個方面，故中醫(yī)藥對該病的治療以補腎、健脾、活血化瘀為基本思路［6］。由于該病晚期致殘率較高，因此越發(fā)重視該病的前期保守治療。在骨生長及修復期，骨的形成主要依靠骨的血管來啟動和完成［7］。臨床大劑量應用激素后引起血管損傷，股骨頭血供中斷，從而引起缺血壞死，故改善股骨頭血供、促進股骨頭內(nèi)血管再生是防治激素性股骨頭壞死的關鍵［8］。研究證實［9-10］，BMP-2、VEGF 等細胞因子參與了激素性股骨頭缺血壞死的病理生理過程，該病的發(fā)生與BMP-2、VEGF表達異常密切相關。BMP-2是一類具有促進軟骨細胞增殖與分化、促進毛細血管內(nèi)皮細胞增殖功能的細胞生長因子，對血液循環(huán)重建具有重要作用［11］；VEGF作為調(diào)控血管生成的重要細胞因子，其促進微血管形成作用對股骨頭壞死的病理演變及壞死修復起重要作用，VEGF可通過調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨的微血管生成而參與骨形成［12］。

生骨再造丸是甘肅省名中醫(yī)張曉剛教授的經(jīng)驗方，有補肝益腎、益氣活血、通陽利濕的功效。方中淫羊藿、鹿角膠、骨碎補等補肝腎，強筋骨；黃芪補益脾肺之氣，配合丹參、三七、血竭、山楂等行氣活血化瘀，促進氣血運行。前期實驗發(fā)現(xiàn)生骨再造散可縮短骨折愈合過程所需時間，提高骨折愈合質(zhì)量［13］，還可明顯降低家兔血漿黏度、全血黏度和紅細胞壓積，認為生骨再造散防止激素性股骨頭壞死的發(fā)生和發(fā)展的機理可能與其對血液流變學的調(diào)節(jié)作用有關［14］。髓芯減壓術(shù)作為治療股骨頭缺血性壞死的一種方法已有30余年歷史。其通過降低骨內(nèi)高壓，排出壞死組織，刺激加壓孔周圍的血管形成，增強壞死骨的爬行替代，使壞死灶得以消除［15］。本研究中髓芯減壓術(shù)在一定程度上降低了股骨頭壞死的發(fā)生率，但是作用有限，聯(lián)合生骨再造丸能改善股骨頭血液循環(huán)，有效增加股骨頭骨密度，提高骨強度，阻止股骨頭變形，較單一采用髓芯減壓術(shù)效果明顯。

本研究通過觀察實驗動物組織病理學及骨組織BMP-2及VEGF mRNA的表達發(fā)現(xiàn)，生骨再造丸能夠有效促進家兔股骨頭壞死部位骨組織沉積，減少空陷窩率，并上調(diào)BMP-2及VEGF mRNA在骨組織中的表達。提示生骨再造丸可能通過提高BMP-2及VEGF表達，促進股骨頭血管新生和改善其血液循環(huán)從而起到防治激素性股骨頭壞死的作用，為臨床治療該病提供了新的理論依據(jù)。