魏玉嬌,何 玲,郭小榮,曹林忠 ,張虎林 ,張曉剛,郭成龍△
1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730020;2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
激素性股骨頭壞死是使用激素最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,發(fā)病率高、致殘率高,臨床治療手段有限,給患者心理、經(jīng)濟(jì)帶來(lái)壓力[1]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn),髓芯減壓聯(lián)合生骨再造丸對(duì)早期激素性股骨頭壞死療效明顯[2]。本研究通過(guò)觀察骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討生骨再造丸對(duì)激素性股骨頭壞死的防治機(jī)理。
1.1 動(dòng)物 健康成年雄性青紫藍(lán)兔60只,體質(zhì)量(2.0±0.20)kg,清潔等級(jí)二級(jí),由甘肅省生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(甘)2015-0001,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。
1.2 藥物 生骨再造丸由黃芪、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、血竭、三七等藥物組成(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院純中藥制劑,批號(hào):151207);大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS,美國(guó)Sigma公司,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20040139,批號(hào):LL0411,規(guī)格:25 mg/ 瓶);甲強(qiáng)龍(美國(guó)輝瑞生物制藥公司,批號(hào):F4088306);青霉素(80萬(wàn)U,哈藥集團(tuán)制藥總廠,批號(hào):F40088305)。
1.3 試劑 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、戊巴比妥鈉、乙二胺四乙酸二鈉由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨研所提供,均購(gòu)自天津華生試劑有限公司。
1.4 儀器 ZT-12J1型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所);OLYMPUS VANOX型自動(dòng)光學(xué)顯微鏡(JAPAN);OLYMPUS型生化儀(日本,LC-005);202-ZAB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);總RNA提取試劑盒Ⅱ(美國(guó) OMEGA 公司,批號(hào):R6934);TIANScript cDNA型第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司,批號(hào):RT120420);PCR 引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司);2×Taq PCR Master Mix 型(天根生化科技有限公司,批號(hào):KT201-02);50bp DNA Ladder Marker(北京博凌科為生物科技有限公司,批號(hào):M07-01)。
1.5 方法
1.5.1 動(dòng)物分組 60只青紫蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,即N組:正常對(duì)照組(8只);Y組:模型對(duì)照組,M組:生骨再造丸組,S組:手術(shù)組,SM組:綜合治療組,每組13只。
1.5.2 動(dòng)物造模 兔子耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS,Sigma 公司產(chǎn)品)50 μg/kg 共 2 次,每次間隔24小時(shí),最后1次注射LPS后臀肌注射甲基強(qiáng)的松龍(MP,20 mg/kg)共3次,每次間隔24小時(shí)。4周后模型成立。
1.5.3 給藥及飼養(yǎng) 模型成立后第2天開(kāi)始灌胃,灌胃劑量按照人與家兔體表面積折算的等效劑量比例換算,生骨再造丸配制成每毫升所含生藥相當(dāng)于3 g原藥材的濃縮液,M組、SM組給藥劑量4.6 mL/(kg·d),連續(xù)灌胃 8周。N 組和 Y 組予等量[4.6 mL/(kg·d)]生理鹽水連續(xù)灌胃 8周。單籠標(biāo)準(zhǔn)兔子顆粒飼料喂養(yǎng)(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),自由飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng),控制室溫在(22±1)℃,光照與黑暗時(shí)間為每12小時(shí)交替。
1.5.4 手術(shù)方法 手術(shù)組采用髓芯減壓術(shù)治療。動(dòng)物俯臥于手術(shù)臺(tái)上,局部備皮后消毒,沿大轉(zhuǎn)子切開(kāi)皮膚、皮下,分離肌肉及骨膜,在大轉(zhuǎn)子上用2 mm細(xì)鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆孔,以不越過(guò)股骨頭軟骨面為界。徹底清除髓腔后關(guān)閉切口,術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素10萬(wàn)U以預(yù)防感染,1次/d,共1周。
1.5.5 取材與處理 第11周采用靜脈推注空氣法處死家兔,觀察大體標(biāo)本。然后完整無(wú)損地切取雙側(cè)股骨頭,將雙側(cè)股骨頭沿正中冠狀面剖開(kāi),4%多聚甲醛液固定,10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣,系列酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔脂肪細(xì)胞變化,計(jì)數(shù)空骨陷窩,計(jì)算空骨陷窩率。
1.5.6 BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)的檢測(cè) 清除股骨頭表面組織,沿基底部將股骨頭鋸下后沿矢狀面剖開(kāi),取骨組織50 mg,按試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,用微量核酸蛋白分析儀計(jì)算所提RNA含量和純度。取總RNA 2μg,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA,β-actin 上游引物:5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′,下游引物:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′;BMP-2 上游引物:5′-GTCCTGAGCGAGTTCGAGTT-3′,下游引物:5′-TGAAGCTCTGCTGAGGTCAT-3′;VEGF 上游引物:5′-AGGAGACAATAAACCCCACG-3′,下游引物:5′-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3′。
β-actin、BMP-2、VEGF 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為:375bp、308bp、187bp。PCR 擴(kuò)增條件(25 μL體系):94℃預(yù)變性2分鐘;95℃變性30 s,退火溫度30 s(β-actin 55℃、TGF-β154℃、CTGF 56℃)72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃再延伸5分鐘,4℃冷卻5分鐘。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定灰度值,以β-actin mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照,以BMP-2 mRNA和VEGF mRNA值與β-actin mRNA的灰度比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示,采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 大體觀察 N組動(dòng)物精神飲食活動(dòng)正常,無(wú)死亡。造模各組在臀肌注射甲基強(qiáng)的松龍(MP)后出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、皮毛失去光澤、體毛干枯脫落、皮下脂肪減少、大便溏薄等表現(xiàn)。至第3周時(shí)上述表現(xiàn)逐漸消失,動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)明顯變化,精神狀態(tài)及活動(dòng)良好。
2.2 股骨頭標(biāo)本觀察 各組股骨頭標(biāo)本外形大體正常,關(guān)節(jié)軟骨變薄、略蒼白色,未見(jiàn)明顯軟骨剝脫或股骨頭塌陷。HE染色Y組骨小梁排列散亂、稀疏、部分骨小梁萎縮、斷裂,周圍無(wú)成骨細(xì)胞,骨髓內(nèi)造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死,骨髓腔擴(kuò)大。M組骨髓內(nèi)血管擴(kuò)張,骨小梁稍細(xì),結(jié)構(gòu)基本完整,骨小梁周圍偶見(jiàn)少量成骨細(xì)胞,空骨陷窩較Y組減少,脂肪細(xì)胞較多,造血細(xì)胞較多,骨髓細(xì)胞分布不均勻。S組骨小梁變細(xì),結(jié)構(gòu)基本完整,形態(tài)不規(guī)則、骨髓內(nèi)大面積造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死,壞死周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。SM組骨小梁粗大、結(jié)構(gòu)基本完整,骨小梁周圍可見(jiàn)大量成排骨母細(xì)胞,脂肪細(xì)胞少,軟骨下骨細(xì)胞飽滿、空陷窩少,可見(jiàn)大量造血細(xì)胞,骨髓細(xì)胞分布均勻。M組、S組、SM組骨小梁較Y組密集,脂肪細(xì)胞逐次減少,造血細(xì)胞增多,有利于骨壞死的修復(fù),其中S組和SM組尤為明顯。與Y組比較,各治療組空陷窩率均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以MS組降低最為顯著(P<0.01),見(jiàn)圖1—4及表1。
圖1 模型對(duì)照組(Y組,×400)
圖2 生骨再造丸組(M組,×400)
圖3 手術(shù)組(S組,×400)
圖4 綜合治療組(SM組,×400)
表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較(±s) %
表1 各組家兔股骨頭空陷窩率比較(±s) %
注:與模型對(duì)照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01
組別 只數(shù) 空陷窩率模型對(duì)照組 12 24.34±3.52生骨再造丸組 12 17.32±2.51*手術(shù)組 12 19.68±1.75*綜合治療組 12 14.30±2.06**
2.3 各組兔股骨頭骨組織中BM P-2及V EG Fm RN A表達(dá) 與Y組比較,各治療組BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)升高,其中M及MS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以MS組BMP-2及 VEGFmRNA水平升高最為顯著(P<0.01),見(jiàn)表 2。
表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)比較(±s)
表2各組家兔BM P-2與V EG F m RN A表達(dá)比較(±s)
注:與模型對(duì)照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01
組別 只數(shù) BM P-2 V EG F模型對(duì)照組 12 0.22±0.02 0.36±0.04生骨再造丸組 12 0.42±0.05** 0.58±0.04*手術(shù)組 12 0.28±0.05 0.44±0.07綜合治療組 12 0.49±0.06** 0.76±0.08**
激素性股骨頭壞死是一種應(yīng)用激素后造成的以無(wú)菌性骨壞死為特征的疾病,是無(wú)創(chuàng)性股骨頭壞死的首要原因,然而,目前針對(duì)激素性股骨頭壞死的現(xiàn)有臨床治療方案收效甚微[3]。激素性股骨頭壞死屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨蝕”“痹癥”“骨痹”“髖骨痹”“骨蔞”等范疇[4]。該病的發(fā)生與先天不足、后天失養(yǎng)、外傷等因素密切相關(guān)[5]。臨床對(duì)該病的認(rèn)識(shí)雖各有側(cè)重,但不外乎虛、痰、瘀3個(gè)方面,故中醫(yī)藥對(duì)該病的治療以補(bǔ)腎、健脾、活血化瘀為基本思路[6]。由于該病晚期致殘率較高,因此越發(fā)重視該病的前期保守治療。在骨生長(zhǎng)及修復(fù)期,骨的形成主要依靠骨的血管來(lái)啟動(dòng)和完成[7]。臨床大劑量應(yīng)用激素后引起血管損傷,股骨頭血供中斷,從而引起缺血壞死,故改善股骨頭血供、促進(jìn)股骨頭內(nèi)血管再生是防治激素性股骨頭壞死的關(guān)鍵[8]。研究證實(shí)[9-10],BMP-2、VEGF 等細(xì)胞因子參與了激素性股骨頭缺血壞死的病理生理過(guò)程,該病的發(fā)生與BMP-2、VEGF表達(dá)異常密切相關(guān)。BMP-2是一類具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與分化、促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子,對(duì)血液循環(huán)重建具有重要作用[11];VEGF作為調(diào)控血管生成的重要細(xì)胞因子,其促進(jìn)微血管形成作用對(duì)股骨頭壞死的病理演變及壞死修復(fù)起重要作用,VEGF可通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨的微血管生成而參與骨形成[12]。
生骨再造丸是甘肅省名中醫(yī)張曉剛教授的經(jīng)驗(yàn)方,有補(bǔ)肝益腎、益氣活血、通陽(yáng)利濕的功效。方中淫羊藿、鹿角膠、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)肝腎,強(qiáng)筋骨;黃芪補(bǔ)益脾肺之氣,配合丹參、三七、血竭、山楂等行氣活血化瘀,促進(jìn)氣血運(yùn)行。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生骨再造散可縮短骨折愈合過(guò)程所需時(shí)間,提高骨折愈合質(zhì)量[13],還可明顯降低家兔血漿黏度、全血黏度和紅細(xì)胞壓積,認(rèn)為生骨再造散防止激素性股骨頭壞死的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理可能與其對(duì)血液流變學(xué)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[14]。髓芯減壓術(shù)作為治療股骨頭缺血性壞死的一種方法已有30余年歷史。其通過(guò)降低骨內(nèi)高壓,排出壞死組織,刺激加壓孔周圍的血管形成,增強(qiáng)壞死骨的爬行替代,使壞死灶得以消除[15]。本研究中髓芯減壓術(shù)在一定程度上降低了股骨頭壞死的發(fā)生率,但是作用有限,聯(lián)合生骨再造丸能改善股骨頭血液循環(huán),有效增加股骨頭骨密度,提高骨強(qiáng)度,阻止股骨頭變形,較單一采用髓芯減壓術(shù)效果明顯。
本研究通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織病理學(xué)及骨組織BMP-2及VEGF mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn),生骨再造丸能夠有效促進(jìn)家兔股骨頭壞死部位骨組織沉積,減少空陷窩率,并上調(diào)BMP-2及VEGF mRNA在骨組織中的表達(dá)。提示生骨再造丸可能通過(guò)提高BMP-2及VEGF表達(dá),促進(jìn)股骨頭血管新生和改善其血液循環(huán)從而起到防治激素性股骨頭壞死的作用,為臨床治療該病提供了新的理論依據(jù)。