王 玲，吳秋楓

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430064

目前，糖尿病發(fā)病率居高不下，已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和癌癥之后的世界第三大疾?。?-2］，美國腎臟病基金會發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2007年全世界范圍內(nèi)糖尿病患者約為1.71億，專家預(yù)計未來10年的時間里糖尿病的發(fā)病率將由6%激增到10%，嚴(yán)重危害人類健康［3］。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、微量白蛋白尿、脂代謝紊亂和進(jìn)行性腎功能喪失為特征，是導(dǎo)致終末期腎?。‥SRD）的重要原因［4-6］。氧化應(yīng)激是引起DN發(fā)生及發(fā)展的重要因素，其可能單獨(dú)或作為上述機(jī)制的下游環(huán)節(jié)在糖尿病腎臟損害的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。燈盞乙素（scutellarin，SC）又名黃芩素苷，是從菊科植物燈盞花提取的黃酮類物質(zhì)，臨床常用于治療高血壓、腦血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等［7-9］。前期研究發(fā)現(xiàn)，SC對ROS誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠過氧化損傷有保護(hù)作用，SC能改善肝臟細(xì)胞氧化還原能力。本研究探討SC對DN大鼠的腎功能保護(hù)作用，并從核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor 2 related factor 2，Nrf2）/ 血紅素加氧酶 1（heme oxygenase，HO-1）途徑探討 SC 通過減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)從而緩解DN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗動物學(xué)部提供，實(shí)驗動物合格證號：SYXK（滇）2011-0004，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)、安靜，血糖正常，大鼠自由飲水、進(jìn)食，溫度（23±2）℃，相對濕度（55±2）%。

1.2 藥物與試劑 燈盞乙素，純度98%（HPLC），購自云南植物藥業(yè)有限公司；高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料78.8%、蛋黃粉10%、豬油 10%、膽固醇 1%、膽酸鈉0.2%；鏈尿佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；葡萄糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；胰島素、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（武漢欣博盛生物科技公司）；總RNA提取試劑盒（北京天根公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛公司）；引物基因合成（美國上海生工生物公司）；熒光PCRmix（瑞士羅氏公司）；Nrf2和HO-1抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；HRP標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 D N大鼠模型制備及給藥 將SD大鼠50只隨機(jī)分為正常對照組、模型組，正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，4周后對模型組大鼠以STZ溶液（60 mg/kg）腹腔注射造模，72小時后大鼠尾部取血測血糖，血糖大于16.7 mmol/L者為造模成功，未成功者予以剔除。40只造模成功大鼠再隨機(jī)分為DN模型組及SC低、中、高劑量組各10只，SC低、中、高劑量組大鼠分別予［25 mg/（kg·d）］、［50 mg/（kg·d）］和［100 mg/（kg·d）］SC 灌胃，DN 模型組大鼠予相同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4周。

1.3.2 標(biāo)本采集 腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉大鼠，無菌操作暴露腹腔，使用5 mL注射器心臟迅速取血，靜置約1小時后5 000 r/min離心15分鐘，獲得血清，同時收集腎臟組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血清各項指標(biāo)測定 采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量；采用光譜測定法測定葡萄糖、TG、TC和LDL-C含量；采用ELISA法測定SOD、MDA和GSH含量。

1.3.4 RN A提取及RT-qPCR檢測 取約18mg腎臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量后每組各取2 μg用于逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后以2 μL的cDNA為模板，加入熒光Mix染料進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性 10秒、退火：60℃30秒、72℃延伸 35秒，循環(huán)40次，72℃延伸5分鐘。分別記錄每個標(biāo)本和內(nèi)參的Ct值（Cycle threshold，即每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。采用熒光定量PCR相對定量分析2-△△CT法進(jìn)行統(tǒng)計分析。每組實(shí)驗至少重復(fù)3次。

1.3.5 蛋白提取及蛋白免疫印跡（W est ern Bl ot）檢測 取腎臟組織約100 mg剪碎加入RIPA組織裂解液勻漿，BCA法測定總蛋白含量，取各樣本50 μg 進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，110 V 電壓，電泳90～120分鐘，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2小時后一抗，4℃過夜，洗膜后加入相應(yīng)辣根酶標(biāo)記的二抗孵育，洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片，掃描圖像后用Image J軟件計算各條帶的吸光度值，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實(shí)驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BU N及Scr變化情況 與正常對照組比較，DN模型組大鼠血清BUN和Scr含量升高（P＜0.05）；與DN模型組比較，治療4周后SC各劑量組BUN和Scr含量均下降（P＜0.05），且具有劑量依賴性，見表1。

表1 各組大鼠BU N及Scr變化情況（±s）

表1 各組大鼠BU N及Scr變化情況（±s）

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05；#表示與D N模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) BU N/（m m ol·L-1） Scr/（μm ol·m L-1）正常對照組 10 5.01±0.98 31.22±3.78 D N模型組 10 15.75±2.14* 99.67±10.21*SC低劑量組 10 10.34±1.15# 71.33±8.01#SC中劑量組 10 8.61±1.09# 62.89±6.99#SC高劑量組 10 7.21±1.10# 55.35±6.11#

2.2 葡萄糖、胰島素及H O M A-IR變化情況 與正常對照組比較，DN模型組大鼠血清中葡萄糖含量、胰島素含量以及HOMA-IR均升高（P＜0.05）；與DN模型組比較，SC各劑量組各指標(biāo)均下降（P＜0.05），且SC低、中、高劑量組大鼠腎功能的改善效果依次遞增，見表2。

表2 各組大鼠H O M A-IR變化情況（±s）

表2 各組大鼠H O M A-IR變化情況（±s）

注：胰島素抵抗指數(shù)（H O M A-IR）=G l ucose×Insul i n/22.5；* 表示與正常對照組比較，P＜0.05；#表示與D N模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 葡萄糖/（m m ol·L-1）胰島素/（m U·m L-1） H O M A-IR正常對照組 10 5.55±0.71 14.36±2.12 3.54±0.78 D N模型組 10 20.45±2.85* 28.11±3.10* 25.55±4.34*SC低劑量組 10 14.23±1.78# 19.21±2.65# 12.15±1.78#SC中劑量組 10 12.17±2.32# 17.37±2.15# 9.40±1.11#SC高劑量組 10 9.53±1.34# 15.77±2.01# 6.68±0.89#

2.3 TG、TC和LD L-C變化情況 與正常對照組相比，DN模型組大鼠血清TG、TC和LDL-C含量升高（P＜0.05）；與DN模型組比較，SC治療4周后大鼠血清TG、TC和LDL-C含量降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性，見表 3。

表3 各組大鼠血清TG、TC和LD L-C變化情況（±s） m m ol/L

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05；#表示與D N模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) TG TC LD L-C正常對照組 10 0.53±0.06 1.12±0.23 0.16±0.02 D N模型組 10 1.51±0.20* 2.65±0.31* 0.49±0.06*SC低劑量組 10 1.03±0.12# 1.92±0.22# 0.32±0.03#SC中劑量組 10 0.81±0.09# 1.76±0.25# 0.24±0.05#SC高劑量組 10 0.62±0.07# 1.45±0.17# 0.18±0.02#

2.4 M D A、SO D及G SH變化情況 與正常對照組比較，DN模型組大鼠血清MDA含量升高（P＜0.05），SOD和GSH含量下降（P＜0.05）；與DN模型組比較，SC治療4周后MDA含量降低（P＜0.05），SOD 和 GSH 含量升高（P＜0.05），且 SC 低、中、高劑量組大鼠腎功能的改善效果依次遞增，見表4。

表4 各組大鼠血清M D A、SO D及G SH變化情況（±s）

表4 各組大鼠血清M D A、SO D及G SH變化情況（±s）

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05；#表示與D N模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) M D A/（nm ol·m L-1） SO D/（U·L-1） G SH/（m m ol·m L-1）正常對照組 10 4.02±0.42 1.13±9.88 8.54±0.92 D N模型組 10 11.34±1.35* 31.21±4.16* 2.51±0.35*SC低劑量組 10 8.11±0.78# 2.34±7.35# 5.64±0.44#SC中劑量組 10 7.12±0.67# 77.42±7.97# 6.85±0.71#SC高劑量組 10 5.68±0.65# 89.60±9.63# 8.22±0.93#

2.5 N rf2和H O-1的m RNA表達(dá)情況 與正常對照組比較，DN模型組大鼠Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與DN模型組比較，SC治療4周后Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），且SC低、中、高劑量組的治療效果依次遞增，具有劑量依賴性，見圖1。

圖1 N rf2和H O-1的m RN A表達(dá)情況

2.6 N rf2和H O-1蛋白表達(dá)情況 與正常對照組比較，DN模型組大鼠Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），SC灌胃4周后Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），且 SC 低、中、高劑量組的治療效果依次遞增，具有劑量依賴性，見圖2。

圖2 N rf2和H O-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

SC作為一類常見的中藥提取物，是燈盞花的主要活性成分，其降糖、降脂、增強(qiáng)胰島素敏感性以及抗氧化等作用是其藥理作用的重要方面，目前已成為腎臟病治療的常用藥物［10-12］。不少學(xué)者通過動物模型模擬DN的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)及分子信號通路的改變來研究中藥的作用機(jī)理并發(fā)掘DN治療的新靶點(diǎn)。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)合并STZ腹腔注射的方法建立DN大鼠模型，可復(fù)制出接近DN多因素致病特點(diǎn)的動物模型。本研究結(jié)果表明SC能降低DN大鼠血液中的Scr及BUN含量，有降低DN大鼠體內(nèi)IR，減少脂質(zhì)沉積的作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)DN的重要方面。機(jī)體內(nèi)促氧化物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)相互作用來保持平衡狀態(tài)。一旦出現(xiàn)各種病理因素，促氧化物質(zhì)增多或抗氧化物質(zhì)減少以及抗氧化反應(yīng)不充分就會產(chǎn)生ROS從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激［13-14］，本研究結(jié)果表明DN模型大鼠血清GSH、SOD含量降低，MDA升高。在生理狀態(tài)下，適量的ROS能迅速被腎臟內(nèi)抗氧化物質(zhì)（如SOD、GSH等）清除，在糖尿病或高血糖環(huán)境中，來自機(jī)體的各種因素都有可能誘導(dǎo)ROS過多生成，超過了抗氧化物質(zhì)的清除能力，便可誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并激活胞內(nèi)多條相關(guān)信號通路。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞存活中具有重要作用，Nrf2可激活一系列抗氧化酶（包括HO-1）的合成，以促進(jìn)失衡的氧化還原反應(yīng)恢復(fù)平衡，減輕自由基損傷。在氧化應(yīng)激等情況下，Keap1會與Nrf2解離，導(dǎo)致Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，以此來啟動抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激和親核化合物的抗性，其下游抗氧化基因包括HO-1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-Stransferase，GST）等，特別是 HO-1 表達(dá)增加可增強(qiáng)其抗氧化能力，能夠保護(hù)機(jī)體免受活性氧的侵害［15-17］。本研究表明與正常對照組比較，DN模型組大鼠Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，SC治療4周后腎臟中Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，且SC低、中、高劑量組的治療效果依次遞增，具有明顯劑量依賴性。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用，SC可改善DN大鼠腎功能、降低體內(nèi)IR與脂質(zhì)沉積，并通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而緩解DN。