趙 陽

邯鄲市中心醫(yī)院免疫科，河北 邯鄲 056001

肝癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其致死率居惡性腫瘤第二位，嚴重威脅人類生命健康。病理生理學研究［1-2］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者多處于免疫系統(tǒng)抑制、免疫活性細胞功能低下狀態(tài)，從而使腫瘤細胞易于生長和轉移，因此以改善患者免疫功能為切入點可能是研發(fā)高效、低毒新型抗腫瘤藥物的新思路。紫草素是中藥紫草的主要活性成分，具有抗炎、增強機體免疫功能等生物學活性［3-4］。本研究通過腋窩皮下注射接種肝癌Walker-256細胞的方法建立荷肝癌大鼠模型并給予不同濃度紫草素干預治療，探討紫草素對荷肝癌大鼠免疫功能的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 清潔級雄性Wistar成年大鼠和Wistar大鼠幼鼠購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003；肝癌Walker-256細胞株購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院。

1.2 藥物與試劑 紫草素[中國藥品生物制品檢定所（純度≥98%]；注射用順鉑（山東齊魯制藥有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；噻唑藍（MTT，Sigma 公司）；白細胞介素 2（IL-2）、腫瘤壞死因子α （TNF-α）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精-君紅（HE）染色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備、分組與給藥 荷肝癌大鼠模型的制備：實驗用人肝癌HepG2細胞株常規(guī)解凍復蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞經0.25%胰酶消化并調整濃度為4×106個/mL，無菌條件下注射接種于Wistar大鼠幼鼠腹腔，1周后抽取癌性腹水1 mL注射接種于Wistar成年大鼠右腋窩皮下，1周后出現(xiàn)大小約1 cm×1 cm×1 cm瘤體即可判定造模成功。取100只模型大鼠隨機分為模型組、紫草素［40、20、10 mg/（kg·d）］組和順鉑［2 mg/（kg·d）］組，各20只，分別給予相應藥物進行干預，模型組同步給予等體積生理鹽水，療程14天。

1.3.2 各組大鼠瘤體生長狀況 觀察各組大鼠瘤體特征，包括瘤體大小、活動度、硬度等。

1.3.3 抑瘤率的計算 頸椎脫臼處死動物后剝取腫瘤組織并稱重。

1.3.4 腫瘤組織形態(tài)結構 取稱重后瘤體，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，行常規(guī)HE染色和復染，采用顯微鏡觀察并照相保存。

1.3.5 脾淋巴細胞轉化率 頸椎脫臼處死動物后開腹取脾臟組織，研磨勻漿后經200目篩過濾，離心取細胞，加入10 mL NH4Cl，37℃水浴10分鐘，將細胞懸浮于培養(yǎng)液（2 mL）并調整細胞濃度為2×106/mL；各組細胞均接種于96孔板，設6個復孔｛3個實驗孔［滴加100μL植物血凝素（PHA）液］、3個對照孔（滴加 100 μL 培養(yǎng)液）｝；37℃、5%CO2培養(yǎng)48 小時后每孔加入 20 μLMTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時后去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）200 μL，10分鐘后由酶標儀測定波長490 nm處吸光度（OD）值，以刺激指數(shù)（SI）反映脾淋巴細胞轉化率：SI=PHA刺激孔OD/對照孔OD。

1.3.6 血清IL-2、TN F-α含量 麻醉后開腹并經腹主動脈取血，1 500 rpm離心10分鐘，取血清，通過酶標儀測定各組大鼠血清中IL-2、TNF-α含量。1.3.7 血液CD 4+、CD 8+百分率的測定及CD 4+/CD 8+比值的計算 麻醉后開腹并經腹主動脈取血，10 000 rpm離心5分鐘，取細胞，經磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后滴加70%乙醇5 mL，4℃環(huán)境放置48小時后離心去除乙醇，約1 mL PBS溶液打散細胞團后加水解酶5μL（10mg/mL），37℃放置 1小時后加入碘化丙啶100 μg/mL，避光孵育30分鐘后通過流式細胞儀檢測CD4+、CD8+百分率并計算CD4+/CD8+比值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0軟件分析數(shù)據，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對荷肝癌大鼠瘤體特征的影響 經腋窩皮下注射接種肝癌Walker-256細胞1周后接種部位出現(xiàn)大小約1 cm×1 cm×1 cm瘤體，荷肝癌大鼠瘤體組織呈現(xiàn)質硬、活動、不粘連等特征。與模型組比較，經紫草素治療14天后荷肝癌大鼠瘤體組織減小、活動度和硬度降低，并且呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

2.2 紫草素對荷肝癌大鼠腫瘤組織形態(tài)結構的影響 模型組大鼠荷瘤體組織細胞呈橢圓形、胞質飽滿、核仁深染，細胞核多以2個或多個呈現(xiàn)，未見異常；與模型組比較，紫草素各劑量組和順鉑組大鼠荷腫瘤組織細胞呈現(xiàn)皺縮、數(shù)量減少、間隙增大，腫瘤組織出現(xiàn)不同程度片狀壞死區(qū)，紫草素各劑量組呈現(xiàn)一定劑量依賴性，見圖1。

圖1 紫草素對荷肝癌大鼠腫瘤組織形態(tài)結構的影響（H E×400）

2.3 紫草素對荷肝癌大鼠抑瘤率的影響 與模型組比較，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或順鉑 2 mg/（kg·d）治療 14 天能夠提高荷肝癌大鼠抑瘤率（P＜0.01）；紫草素（40 mg/（kg·d））組抑瘤率與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.4 紫草素對荷肝癌大鼠脾淋巴細胞轉化率的影響 與模型組比較，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或順鉑 2 mg/（kg·d）治療 14天能升高荷肝癌大鼠脾淋巴細胞轉化率（P＜0.05）；并且紫草素［40 mg/（kg·d）］組脾淋巴細胞轉化率高于順鉑 2 mg/（kg·d）組（P＜0.05），見表 1。

表1 LP對荷肝癌大鼠抑瘤率和脾淋巴細胞轉化率的影響（±s） %

表1 LP對荷肝癌大鼠抑瘤率和脾淋巴細胞轉化率的影響（±s） %

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與順鉑組比較，△表示P＜0.05

組別 只數(shù) 抑瘤率 脾淋巴細胞轉化率模型組 20 0.0±0.0 1.03±0.05順鉑 2 m g/（kg·d）組 20 43.6±3.7** 1.21±0.07*紫草素 40 m g/（kg·d）組 20 48.1±4.0** 1.42±0.12**△紫草素 20 m g/（kg·d）組 20 32.2±3.5** 1.23±0.09*紫草素 10 m g/（kg·d）組 20 21.8±2.6** 1.18±0.12

2.5 紫草素對荷肝癌大鼠血清中炎癥因子水平的影響 與模型組比較，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或順鉑 2 mg/（kg·d）治療14天能降低荷肝癌大鼠血清IL-2、TNF-α含量（P＜0.05）；并且紫草素［40 mg/（kg·d）］組 IL-2 含量低于順鉑 2 mg/（kg·d）組，TNF-α含量2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 紫草素對荷肝癌大鼠血清中炎癥因子水平的影響（±s） pg/m L

表2 紫草素對荷肝癌大鼠血清中炎癥因子水平的影響（±s） pg/m L

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與順鉑組比較，△表示P＜0.05

組別 只數(shù) IL-2 TN F-α模型組 20 109.7±18.5 228.7±30.4順鉑 2 m g/（kg·d）組 20 78.4±13.2** 127.4±19.2**紫草素40 m g/（kg·d）組 20 62.1±10.3**△ 138.5±21.3**紫草素 20 m g/（kg·d）組 20 85.9±16.0* 180.9±25.6*紫草素 10 m g/（kg·d）組 20 101.7±19.5 206.7±31.8

2.6 紫草素對荷肝癌大鼠血液CD 4+、CD 8+百分率及CD 4+/CD 8+比值的影響 與模型組比較，紫草素［40 mg/（kg·d）］或順鉑2 mg/（kg·d）治療14天能提高荷肝癌大鼠血液CD4+百分率（P＜0.05），經紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或順鉑 2mg/（kg·d）治療14天能降低CD8+百分率并提高CD4+/CD8+比值（P＜0.05）；紫草素［40 mg/（kg·d）］組 CD4+、CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3、圖2。

表3 紫草素對荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率及 CD 4+/CD 8+比值的影響（±s）

表3 紫草素對荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率及 CD 4+/CD 8+比值的影響（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 只數(shù) CD 4+/% CD 8+/% CD 4+/CD 8+模型組 20 21.2±5.3 23.8±7.6 0.89±0.34順鉑 2 m g/（kg·d）組 20 28.0±6.5* 17.3±5.9**1.62±0.51**紫草素 40 m g/（kg·d）組 20 26.8±5.2* 16.9±5.4**1.59±0.48**紫草素 20 m g/（kg·d）組 20 23.1±6.8 20.1±7.3* 1.15±0.36*紫草素 10 m g/（kg·d）組 20 22.4±5.7 21.8±7.6 1.03±0.40

圖2 紫草素對荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率的影響

3 討論

肝癌具有發(fā)病隱匿、轉移及侵襲能力強、進展迅速、惡性度高等特點，多數(shù)患者就診時已達病程中晚期，失去手術機會，目前臨床手術切除率僅為20%［5］，且5年復發(fā)率高達 60%以上，而腫瘤患者免疫系統(tǒng)功能抑制使腫瘤細胞易于生長和轉移是其復發(fā)的主要原因之一［1-2］。

紫草素是一種具有廣泛生物學活性的萘醌類化合物［3-4］，對乳腺癌、喉癌、子宮內膜癌、宮頸癌、白血病等具有一定的抑制作用［6-10］。代巧妹等［4］報道紫草素具有改善機體免疫功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素干預14天能有效降低瘤體活動度和硬度，誘導腫瘤組織細胞凋亡或壞死，提高抑瘤率，降低瘤體重量，提示紫草素對荷肝癌大鼠瘤體生長具有一定的抑制作用。

脾淋巴細胞轉化百分率是反映機體細胞免疫功能的基本指標［11］，也是研究藥物對T淋巴細胞影響的常用方法。IL-2具有促進腫瘤細胞免疫耐受的作用，其對免疫功能的影響與各型免疫細胞所處的狀態(tài)、IL-2濃度及作用時間等因素密切相關［12-13］。Anquetil 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，機體出現(xiàn)癌癥病變后體內TNF-α合成及分泌增加，而TNF-α能夠抑制IgG和lgM的產生，能導致T淋巴細胞不能對腫瘤細胞產生正常的免疫反應。T淋巴細胞CD4+和CD8+分子共同介導細胞免疫應答反應［15］，CD4+/CD8+比值在機體免疫調節(jié)中具有重要作用，其比值變化能準確反映機體免疫狀態(tài)［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)紫草素干預14天能夠有效提高荷肝癌大鼠脾淋巴細胞轉化率，降低IL-2、TNF-α含量，提高CD4+百分率，降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值，提示紫草素具有提高荷肝癌大鼠免疫功能的作用。

總之，紫草素可能通過改善荷肝癌大鼠免疫功能而對瘤體生長起到一定的抑制作用；其機制可能與紫草素能夠有效提高脾淋巴細胞轉化率，降低IL-2、TNF-α含量，提高T淋巴細胞亞群CD4+百分率，降低CD8+百分率和提高CD4+/CD8+比值有關。