余 淵，程 杰

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000；2黃石市愛康醫(yī)院

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）主要是指一類非酒精因素所引起的肝臟細胞脂肪變化癥狀，本病與超重、肥胖以及高脂血癥關(guān)系密切，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP1C）；乙酰輔酶羧化酶 α（ACCα）是誘發(fā) NAFLD的主要原因［1］。關(guān)于NAFLD的治療，過去的研究認為應以調(diào)節(jié)飲食和增加運動為主，藥物治療為輔，但最新研究認為，通過飲食和運動雖可有效預防非酒精性脂肪肝病肝臟脂肪的排出，對于已受損細胞并無修復作用，因此加強藥物治療仍十分必要［2］。近年來玉米須總皂苷對2型糖尿病的作用受到了許多學者的關(guān)注［3］，由于2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病有一個明顯共同點即胰島素抵抗的升高［4］，因此玉米須總皂苷可能對非酒精性脂肪肝病有一定作用。本研究采用高脂高糖飲食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，觀察玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病是否有治療作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境 清潔級Sprague Dawley雄性大鼠100只，體質(zhì)量為180～220 g，購于華中科技大學動物實驗中心，大鼠合格證號：SCXK（鄂）2010-0007。

1.2 高脂飼料組成 基礎(chǔ)飼料和高脂飼料及飼養(yǎng)用墊料均購于華中科技大學動物實驗中心。基礎(chǔ)飼料配方主要為碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，粗纖維5.6%，脂肪2.4%，其他10.0%；高糖、高脂飼料組成：基礎(chǔ)飼料66.5%，蔗糖10%，豬油20%，膽固醇3.4%，膽酸鈉0.1%。1.3 試劑與藥品 玉米須總皂苷（ZMLS）由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供（純度98%）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）試劑盒以及游離脂肪酸（FFA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；戊巴比妥鈉和肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c（SREBP1c）和乙酰輔酶羧化酶 α（ACCα）多克隆抗體以及b-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；抗體稀釋液、二抗、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛購于上?；瘜W試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及造模 大鼠適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為正常組，模型組以及治療組，每組20只。模型組和治療組給予高脂高糖飲食8周建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，模型建立成功的標志為血液生化指標檢測大鼠肝功能異常，同時肝臟組織HE染色有明顯的脂肪空泡。

1.4.2 灌胃給藥 大鼠模型建立成功后治療組予玉米須總皂苷4 mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予生理鹽水灌胃，分別于治療4、8周后處死大鼠，觀察治療效果。

1.4.3 肝臟組織分離及固定 在治療4周和8周后分別予戊巴比妥鈉（3%）30 mg/（kg·d）腹腔注射處死大鼠各半，腹腔注射戊巴比妥鈉約5分鐘后將麻醉大鼠固定于解剖板上，沿腹中線切開，暴露腹腔，取出肝臟，并統(tǒng)一取肝左葉置于中性福爾馬林溶液中保存?zhèn)溆?，其他置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 生化指標的檢測 摘除大鼠肝臟后用10 mL注射器沿心尖處抽取血液并置于1.5 mL離心管中，4 000 rpm離心15分鐘，取上清液保存于超低溫冰箱備用。

1.4.5 H E染色 將心肌組織從4%的福爾馬林中取出，脫水、石蠟包埋、切片、最后進行HE染色，染色后使用光學顯微鏡觀察心肌組織病理學改變。

1.4.6 RT-PCR法檢測SREBP1c和A CCα基因表達 采用總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司提供）提取肝臟中總RNA，提取完成后取2 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)率完成后擴增，擴增條件：94℃預變性 2分鐘，94℃變性 30秒，SREBP1c 48.6℃退火 30s（ACCα46.8℃退火 30 秒），72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃總延伸5分鐘。完成后每組各取5 μL PCR產(chǎn)物，0.5%的瓊脂糖電泳，最后采用凝膠成像儀采集圖像，Image J計算每個條帶熒光強度值，每組實驗重復3次，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.7 蛋白免疫印跡法（W est ern bl ot t i ng）檢測肝臟組織SREBPl c和A CCa的表達 組織細胞裂解液裂解肝臟組織后離心提取總蛋白，每組各取60 μg以10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離。電泳完成后立即轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜（半干轉(zhuǎn)移法），轉(zhuǎn)移完成后3%脫脂牛奶封閉2小時，完成后加入相應1抗（1∶1500）封閉袋中搖床1小時，之后置于4℃冰箱中過夜孵育；次日洗滌3次后加入相應二抗（l∶3000）孵育2小時，洗滌3次后立即進行化學發(fā)光法曝光，之后壓片。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)印跡條帶灰度，每組實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS l9.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠毛發(fā)順暢發(fā)白，飲食、飲水正常，活潑好動；模型組大鼠飲食和飲水量均較大，毛發(fā)沾有黃色尿液，呈明顯的肥胖特征；治療組大鼠一般情況介于空白組和模型組之間。

2.2 A ST和A LT變化情況 與正常組相比，模型組大鼠AST和ALT升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療4周后，治療組大鼠AST和ALT下降（P＜0.05），治療8周后效果更顯著（P＜0.05），見表2。

2.3 血脂水平 與正常組相比，模型組TG和FFA升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療4周后治療組大鼠TG和FFA均下降（P＜0.05），治療8周后進一步降低（P＜0.05），見表 3。

表2 各組大鼠A ST、A LT變化情況（±s） U/L

表2 各組大鼠A ST、A LT變化情況（±s） U/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) A ST A LT治療4周后 治療8周后 治療4周后 治療8周后正常組 10 115.45±12.14 116.38±10.43 34.23±4.26 36.56±3.92模型組 10 234.33±42.54 228.21±33.56 76.34±14.26 75.42±12.54治療組 10 173.17±21.33* 142.17±12.78* 58.27±8.15* 48.87±9.47*

表3 各組大鼠TG、FFA變化情況（±s） m m ol/L

表3 各組大鼠TG、FFA變化情況（±s） m m ol/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) TG FFA治療4周后 治療8周后 治療4周后 治療8周后正常組 10 0.70±0.12 0.69±0.11 0.45±0.06 0.44±0.08模型組 10 1.23±0.26 1.26±0.27 1.12±0.18 1.54±0.13治療組 10 1.02±0.16* 0.92±0.12* 0.89±0.12* 0.82±0.12*

2.4 H E染色 正常組大鼠肝臟肝細胞結(jié)構(gòu)紋理清晰，均以中央靜脈放射狀排列，同時細胞大小一致，排列整齊。模型組大鼠表現(xiàn)明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞腫大，肝組織有大量的脂肪空泡和脂肪變性，細胞核明顯增大，玉米須總皂苷治療4周后大鼠肝細胞仍有一定的腫脹和脂肪變性，治療8周后只有小而少的脂肪空泡，肝細胞大小基本恢復正常，見圖1。

圖1 肝臟組織H E染色（10×20）

2.5 SREBP1c和A CCα蛋白表達 與正常組相比，模型組大鼠SREBP1c和ACCα蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療4周后治療組大鼠SREBP1c和ACCα蛋白含量降低（P＜0.05），治療8周后進一步降低（P＜0.05），見表4及圖2。

表4 治療后大鼠肝臟SREBP1c和A CCα蛋白相對表達量（±s）

表4 治療后大鼠肝臟SREBP1c和A CCα蛋白相對表達量（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) SREBP1c A CCα治療4周后 治療8周后 治療4周后 治療8周后正常組 10 0.72±0.15 0.98±0.11 0.92±0.15 0.64±0.13模型組 10 2.65±0.51 2.24±0.41 2.74±0.43 2.54±0.41治療組 10 1.82±0.35* 1.03±0.21* 1.54±0.26* 0.91±0.15*

圖2 大鼠肝臟SREBP1c和A CCα蛋白表達

2.6 SREBP1c和A CCα m RN A表達 與正常組相比，模型組大鼠SREBP1c和ACCα mRNA表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療4周后治療組大鼠表達下降（P＜0.05），治療8周后進一步下降（P＜0.05），見表5及圖3。

表5 治療后大鼠肝臟SREBP1c和A CCα m N N A相對表達量（±s）

表5 治療后大鼠肝臟SREBP1c和A CCα m N N A相對表達量（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) SREBP1c A CCα治療4周后 治療8周后 治療4周后 治療8周后正常組 10 0.77±0.12 0.85±0.22 1.23±0.21 0.76±0.15模型組 10 2.74±0.43 2.43±0.42 2.92±0.51 2.61±0.47治療組 10 2.01±0.22* 0.93±0.20* 2.11±0.19* 0.81±0.21*

圖3 大鼠肝臟SREBP1c和A CCα m RN A相對表達

3 討論

肝臟是人體最重要的代謝器官，其在體內(nèi)負責糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝與合成，由于脂肪本身屬于能量貯存物質(zhì)，所以當不能完全代謝吸收的脂肪超過了肝臟能清除的脂類，就可造成其在肝臟細胞中的過量聚集，最終導致脂肪肝［5］。脂肪肝病是全世界范圍內(nèi)廣泛流行的疾病，這與人們飲食攝入的增加（非酒精性脂肪肝）或者過量飲酒（酒精性脂肪肝）密切相關(guān)［6］。有研究［7］顯示，非酒精性脂肪肝病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，以西方發(fā)達國家為例，其非酒精性脂肪肝病發(fā)病率約為20%～30%，其中西班牙人高達45%，我國屬于發(fā)展中國家，發(fā)病率相對較低，但也高達12%～24%。其中10%的患者在20年內(nèi)可發(fā)展為肝纖維化，而在肝纖維化的人群中又有30%可在10年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，因此非酒精性脂肪肝病已成為威脅人們健康的一大疾病。

關(guān)于非酒精性脂肪肝的發(fā)生，目前研究認為脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥和氧化應激等均參與了其發(fā)生或發(fā)展［8］，而非酒精性脂肪肝病本身屬于脂代謝類疾病，因此不管是外因刺激，還是本身病變，研究調(diào)節(jié)脂代謝的藥物對于本病的治療具有積極意義［9-11］。而脂質(zhì)代謝在體內(nèi)一般有α、β和γ3條氧化通路［11］，其中α氧化通路是研究最為廣泛也是最為核心的通路之一［12］，目前以 SREBP1c、ACCα為治療非酒精性脂肪病靶點的研究較多［13-14］，如武俊紫等［15］研究報道富硒靈芝可調(diào)節(jié)肝臟組織中ACCα的表達，但對SREBF-1c無直接作用；孫蔚明［16］研究報道紅芪多糖可改善非酒精性脂肪肝病SREBP1c和ACCα的表達，但關(guān)于玉米須總皂苷對2型糖尿病SREBP1c和ACCα的作用目前還沒有報道。

我國是玉米種植大國，早在古代，就有中醫(yī)專家采用玉米須治療糖尿病的研究，近年來隨著分子生物學和細胞生物學的發(fā)展，進一步證實了玉米須的作用，其不僅能降糖，同時對降脂特別是降低體內(nèi)膽固醇具有較好療效［17-18］。此外，玉米須總皂苷和玉米須多糖都有一定的降脂作用，而其中發(fā)揮主要作用的為玉米須總皂苷［19］。本研究結(jié)果顯示，玉米須總皂苷可明顯改善非酒精性脂肪肝病大鼠FFA和TG，表明玉米須總皂苷可調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠血脂功能，玉米須總皂苷可明顯降低大鼠AST和ALT，對肝功能具有較好的作用，此外，玉米須總皂苷可明顯降低2型糖尿病SREBP1c和ACCα的表達，提示玉米須總皂苷對大鼠肝臟中α氧化相關(guān)酶具有一定的調(diào)節(jié)作用。

玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能和血脂具有很好的調(diào)節(jié)作用，這可能與其可調(diào)節(jié)α氧化關(guān)鍵酶SREBP1c和ACCα的表達有關(guān)。