張正順 ，張艷霞 ，陳紹儀 ，孔學(xué)禮 ，周佳瑋

1甘肅省中醫(yī)院白銀分院，甘肅 白銀 730900；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)/甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3白銀市第二人民醫(yī)院

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，為常用中藥，具有調(diào)經(jīng)止痛、補(bǔ)血活血、潤(rùn)腸通便之功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明當(dāng)歸的有效成分有抗腫瘤作用，但當(dāng)歸提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響報(bào)道顯示不一致，甚至有作用相反的研究報(bào)道，臺(tái)灣學(xué)者Chang等［2］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中提取的阿魏酸具有促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。Kim等［3］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸的呋喃類(lèi)化合物體外具有抑制A549、SK-MEL-2等細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。朱曉音等［4］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸水提物有刺激人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖的作用。而當(dāng)歸揮發(fā)油能夠明顯抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人前列腺癌PC3細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示當(dāng)歸中不同提取成分對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可能不同，甚至相反。當(dāng)歸中主要成分之一當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及周期是否有作用，目前尚不確定，本研究采用噻唑藍(lán)（MTT）法研究當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，初步探討當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)GLC-82細(xì)胞增殖及周期的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 當(dāng)歸揮發(fā)油由岷縣康達(dá)藥業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供，制備方法為稱(chēng)取當(dāng)歸飲片1 kg，應(yīng)用置超臨界萃取設(shè)備進(jìn)行CO2超臨界流體萃取，CO2流量 2 L/（kg·h）、壓力 25 MPa、萃取溫度40℃，時(shí)間6小時(shí)，所得當(dāng)歸萃取液過(guò)濾，濾液靜置后取油層，得8.2 g揮發(fā)油，當(dāng)歸揮發(fā)油含量為每100 g藥材含0.82 g，所得當(dāng)歸揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分析，藁本內(nèi)酯含量為81.4%?？ㄣK注射液（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：WB1J1402001，規(guī)格：50mg/10mL）。

1.2 試劑 胎牛血清 FBS Premium，cat.No：P30-3302，Lot.No：P1410047（杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：140126）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco Invitrogen Corporation，U.S.A.產(chǎn)品）；噻唑藍(lán)（MTT，Solarbio 公司產(chǎn)品，Lot.No.3D3H0511，Exp.20200617）；胰酶細(xì)胞消化液（Biosharp 公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)：BL512A）；十二烷基硫酸鈉（SDS，solarbio 公 司 產(chǎn) 品 ，Lot.NO.325E035）；雙 抗（Beyotime 公司產(chǎn)品，編號(hào)：C0222）；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.006 7 M，Hyclone 產(chǎn)品）；細(xì)胞周期試劑盒 （#CCS012 Cell cycle staining kit，LOT#：6223805，聯(lián)科生物產(chǎn)品）。

1.3 細(xì)胞系 人肺腺癌GLC-82細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究所傳代保種。用含10%小牛血清及含1%雙抗（1×105IU/L青霉素和1×105IU/L鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，本細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化液消化，2～3天傳代1次。

1.4 儀器 MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋科研醫(yī)療設(shè)備公司產(chǎn)品）；HF safe 760S型超凈工作臺(tái)（香港力康儀器有限公司產(chǎn)品）；Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀/超微量微孔板紫外分光光度計(jì)（Bio-tec公司產(chǎn)品）；流式細(xì)胞儀（BD FACSVerseTM流式細(xì)胞儀，USA產(chǎn)品）；IX71-22PH型倒置顯微鏡（OLYMPUS產(chǎn)品）；80-1型離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠）；GR60DR型全自動(dòng)高壓滅菌器[致微（廈門(mén)）儀器有限公司]；PB-21型PH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 M TT法測(cè)定當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌G LC-82細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GLC-82細(xì)胞，制備細(xì)胞濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，以90 μL/孔加入96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、當(dāng)歸揮發(fā)油系列濃度（6.25、12.5、25、50、100、150、200 μg/mL）組及相應(yīng)的顏色對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁，加入藥物（10 μL/ 孔），繼續(xù)培養(yǎng)44小時(shí)，加入MTT（10μL/孔），再培養(yǎng) 4小時(shí)后加入 10%SDS（100 μL/ 孔），置培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)GLC-82細(xì)胞的抑制率（IR），公式如下：

1.5.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82細(xì)胞，制備濃度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，分陰性對(duì)照組、當(dāng)歸揮發(fā)油（25、50、75、100、200 μg/mL）組。培養(yǎng) 24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，分別以每瓶1 mL加入藥物或生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105/mL，以每瓶9 mL接種100 mL容量的10個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，分別作為陰性對(duì)照組及當(dāng)歸揮發(fā)油25、50 μg/mL濃度組。培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，分別以每瓶1 mL加入藥物或生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)終止時(shí)收集細(xì)胞沉淀，然后按下述步驟操作：1）用預(yù)冷的PBS洗1遍，離心，棄去上清；2）加入1 mL的DNA染色液和10 μL的破膜劑，渦旋混勻5～10秒。室溫孵育30分鐘。3）流式分析：孵育完的細(xì)胞懸液直接上機(jī)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，MTT 測(cè)定中半數(shù)抑制濃度（IC50）用Curve Expert 1.3軟件做曲線回歸計(jì)算，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌G LC-82細(xì)胞增殖的抑制作用 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)GLC-82細(xì)胞的增殖具有抑制作用，在濃度為6.25～200 μg/mL的劑量范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性。當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)GLC-82細(xì)胞的IC50為 113.03 μg/mL，見(jiàn)表 1。

表1 培養(yǎng)48 h當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)G LC-82增殖的抑制作用（±s）

表1 培養(yǎng)48 h當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)G LC-82增殖的抑制作用（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01；每板各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，為1次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

組別 例數(shù) 劑量/（μg·m L-1） O D值 IR/%陰性對(duì)照組 4 0 0.58±0.09 -6.25 0.53±0.00 0.59±0.12 12.5 0.56±0.08 4.44±2.92 25 0.55±0.09 6.62±2.81當(dāng)歸揮發(fā)油組 4 50 0.47±0.13 20.12±14.40 100 0.36±0.10*36.74±23.02 150 0.14±0.06**75.77±9.39 200 0.06±0.04**89.81±4.79

2.2 倒置顯微鏡觀察G LC-82細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài) 陰性對(duì)照組GLC-82細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，生長(zhǎng)旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)后形態(tài)無(wú)明顯變化。當(dāng)歸揮發(fā)油處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸固縮變圓并與周?chē)?xì)胞分離，折光率減弱，貼壁細(xì)胞減少，部分細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)瓶中，部分細(xì)胞裂解。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞皺縮越明顯，死亡細(xì)胞逐漸增多。濃度為200 μg/mL時(shí)已經(jīng)沒(méi)有形態(tài)完整的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞多呈亮色圓形漂浮在培養(yǎng)液中，見(jiàn)圖1。

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)G LC-82細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)不同細(xì)胞周期中G LC-82的影響 當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組與陰性對(duì)照組比較，G1期GLC-82細(xì)胞明顯減少，G2期GLC-82細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該變化呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表2及圖2。

表2 培養(yǎng)48小時(shí)當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)不同細(xì)胞周期中G LC-82細(xì)胞的影響（±s） %

表2 培養(yǎng)48小時(shí)當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)不同細(xì)胞周期中G LC-82細(xì)胞的影響（±s） %

注：與陰性對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 例數(shù) G 1 S G 2陰性組 3 64.66±1.15 23.54±1.35 3.53±0.70當(dāng)歸揮發(fā)油 25 μg/m L組 3 56.82±0.73** 24.67±2.13 13.32±0.09**當(dāng)歸揮發(fā)油 50 μg/m L組 3 45.89±1.88** 28.68±0.85 21.55±1.13**

圖2 當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)不同細(xì)胞周期中G LC-82細(xì)胞的影響（48 h）

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率一直呈上升趨勢(shì)，是目前全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，平均每30秒就有1 人死于肺癌［5］。肺癌是我國(guó)的第一大癌癥［6］。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%左右，近年來(lái)，NSCLC治療手段及化療新藥層出不窮，但療效未得到進(jìn)一步提高［7-8］，因此，推出高效低毒的新化療藥物是提高療效的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥治療腫瘤的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的中藥提取物對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用得到肯定，中藥單藥有效成分的研究成為熱點(diǎn)［9］，例如，Xie 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，茯苓皮提取物丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯；王家曉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3可明顯誘導(dǎo)、提高荷瘤小鼠特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)；喜樹(shù)果中含有的喜樹(shù)堿、羥基喜樹(shù)堿等對(duì)肺癌有顯著療效［12］；丹參中提取的丹參酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用，且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化［13］；山豆根中含有的苦參堿等可抑制腫瘤細(xì)胞的核酸代謝［14］。本研究結(jié)果表明當(dāng)歸揮發(fā)油在濃度為6.25～200 μg/mL的范圍內(nèi)對(duì)GLC-82細(xì)胞的增殖具有濃度依賴(lài)性抑制作用，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)GLC-82細(xì)胞的 IC50為 113.03 μg/mL。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、多基因和多階段改變的過(guò)程，其中細(xì)胞周期調(diào)控是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制［15］。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組G2期細(xì)胞較陰性對(duì)照組明顯增多，且這種變化呈濃度依賴(lài)性。可以推斷，當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過(guò)阻滯細(xì)胞于G2期起到抑制GLC-82細(xì)胞增殖的作用。