王奧昉 賴 瑛

1 杭州電子科技大學(xué) 浙江 杭州 310018

2 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

復(fù)方降糖顆粒劑為杭州市中醫(yī)院臨床驗(yàn)方，處方由黃芩、黃連、黃芪、山楂、茯苓和葛根6味中藥組成，可適用于早期糖尿病脾虛痰濕及氣滯痰阻證型患者[1]，在降低血糖、改善糖尿病癥狀等方面有顯著的臨床療效。為了提高顆粒劑的質(zhì)量、降低臨床服用量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其殼聚糖澄清工藝進(jìn)行研究，以浸膏粉吸濕性、黃芩苷和小檗堿的含量為指標(biāo)，正交試驗(yàn)法對(duì)殼聚糖澄清工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

1 儀器、材料與試劑

高效液相色譜儀（ST1501，HPLC）；真空干燥箱（DZF-6050，北京永光明醫(yī)療儀器廠）；電子分析天平（FA1004，上海天平儀器廠）；紫外分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；離心機(jī)（TGL205，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-201117供含量測(cè)定用）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110713-200911供含量測(cè)定用）；殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司）；色譜乙腈、甲醇(色譜純，Merck Company)，其余試劑為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司的分析純。中藥材均從浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠購買。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃芩苷和小檗堿的含量測(cè)定：①色譜條件：色譜柱（Agilent TC-C18 250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.02M磷酸（三乙醇胺調(diào)pH至6.78）:乙腈:甲醇=（71:16:13）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；柱溫：室溫；流速：1ml·min-1；進(jìn)樣量20μl。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的黃芩苷和鹽酸小檗堿對(duì)照品20.08mg、3.920mg于25ml容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，得到含黃芩苷803.2μg/ml、含鹽酸小檗堿156.8μg/ml的對(duì)照品溶液，分別取該對(duì)照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別得到含黃芩苷8.032、16.064、32.128、48.192、64.256、80.32μg/ml，含鹽酸小檗堿 1.568、3.136、6.272、9.408、12.544、15.68μg/ml的對(duì)照品溶液。照以上的色譜條件，分別精密量取各試液20μl注入液相色譜儀記錄色譜圖，見圖1（A）。設(shè)進(jìn)樣濃度值為C，峰面積值為A，得黃芩苷一元線性回歸方程：C＝0.0353A－3.397，r＝0.9999，線性范圍 8.032～80.32μg·ml-1；鹽酸小檗堿一元線性回歸方程：C＝0.0155A+0.086，r＝0.9999，線性范圍1.568～15.68μg/ml。③供試品溶液的制備：精密取含生藥1g/ml的藥液0.5ml，水浴蒸干后用80%乙醇15ml超聲提取3次，每次提取1小時(shí)，然后將提取液過濾，將過濾后的提取濾液蒸干，用80%乙醇溶解，定容至10ml。取1ml于5ml容量瓶中定容至刻度，搖勻后再用0.45μm的水性濾膜過濾即得所供試品溶液。樣品圖譜見圖1（B）。

圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC色譜圖

2.2 精密度試驗(yàn)：照上述色譜條件操作，取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得黃芩苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.64%，小檗堿峰面積的RSD為1.71%。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一批次的樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制得供試品6份，在上述相同色譜條件下測(cè)定，結(jié)果黃芩苷含量平均值為4.02mg/ml，RSD為2.29%；小檗堿含量平均值為0.359mg/ml，RSD為2.06%。

2.4 回收率試驗(yàn)：分別精密量取已知黃芩苷和小檗堿含量的同一批樣品溶液9份，每3份為一水平，分別精密加入一定量的黃芩苷和小檗堿對(duì)照品溶液（含量分別為 803.2μg/ml、156.8μg/ml）0.6、1、1.8ml，然后按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在同一色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，可得黃芩苷的平均回收率為95.45%，RSD為3.03%；小檗堿的平均回收率為83.13%，RSD為2.77%。

2.5 吸濕百分率的測(cè)定：取一定量的浸膏粉，放置于30℃烘箱中，恒重48h。用NaCl飽和溶液干燥器，48h后稱量，按如下公式計(jì)算吸濕百分率[2]。試驗(yàn)做兩組，取平均值。吸濕百分率=（吸濕后重量－吸濕前重量）/吸濕前重量×100%。

2.6 正交法優(yōu)選殼聚糖澄清工藝：選取殼聚糖用量、藥液濃度和溫度因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。見表1、表2。

表1 因素水平表

2.6.1 樣品制備：按照正交試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的條件，將提取液稀釋加熱后，緩慢加入殼聚糖膠體溶液，邊加邊攪拌，加完后再繼續(xù)保溫?cái)嚢?5min，然后冷卻至常溫，最后離心取上清濃縮定容至1g/ml，灌封，滅菌，即得。

2.6.2指標(biāo)測(cè)定：吸濕性、黃芩苷、小檗堿，F(xiàn)0.05（2,2）＝19.00，自由度均為2。方差分析結(jié)果見表3。

表2L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表

表3 方差分析結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 因素比較分析：3個(gè)因素中，對(duì)吸濕性影響最大的是C因素，最佳水平是C2；對(duì)黃芩苷影響最大的是A因素，最佳水平是A1；3種指標(biāo)中B因素的3種水平無顯著性差異，直觀分析結(jié)果顯示，B因素的最佳水平均為B1。因此，A、C因素根據(jù)黃芩苷和吸濕性的方差分析結(jié)果，分別選A1和C2；C因素根據(jù)直觀分析選B1；即優(yōu)選出澄清工藝條件為殼聚糖用量占生藥量的0.2%，藥液濃度為0.2g/ml，加入時(shí)的溫度為40～50℃。

3.2 優(yōu)選工藝條件重復(fù)性試驗(yàn)：為驗(yàn)證上述優(yōu)選的殼聚糖澄清工藝最佳條件的穩(wěn)定性，取相同量的藥液3份，按最佳條件A1B1C2操作，平行操作，結(jié)果吸濕性、黃芩苷、小檗堿的平均值分別為22.8%、3.606mg/ml、0.274mg/ml，RSD均小于3%。

4 討論

復(fù)方降糖顆粒劑主要成分有黃芪甲苷、黃芩苷、小檗堿。黃芪甲苷由于在高效液相的紫外檢測(cè)器中響應(yīng)值太低，無法檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)選用了黃芩苷、小檗堿為有效成分檢測(cè)指標(biāo)。殼聚糖是一種含氮陽離子堿性多糖，由于其在澄清吸附過程中較之傳統(tǒng)的醇沉工藝有明顯的優(yōu)勢(shì)，近年來在醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到廣泛關(guān)注[3]。本文通過正交試驗(yàn)法對(duì)復(fù)方降糖顆粒的殼聚糖澄清工藝進(jìn)行了優(yōu)選，以吸濕性、黃芩苷、小檗堿為分析評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出最佳澄清條件，即殼聚糖用量占生藥量的0.2%，藥液濃度0.2g/ml，溫度40～50℃，并按最佳工藝進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，吸濕性小，穩(wěn)定性優(yōu)，有效成分損失少。

5 參考文獻(xiàn)

[1]沈艷.唐紅運(yùn)用活血化瘀法治療糖尿病經(jīng)驗(yàn)[J].浙江中醫(yī)雜志，2010，45（9）：640-641.

[2]王佩，劉曉昱，徐紅.復(fù)方芪苓無糖顆粒劑成型工藝的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014，32（2）：353-356.

[3]羅世江.影響殼聚糖絮凝法澄清效果因素淺析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（12）：455-457.