葉 平 葉 騫 胡藍(lán)雅文 王歡歡 王百苗 董盼攀

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2次于孕齡為20孕周之前的妊娠物或胎兒丟失(體質(zhì)量＜500g)[1]。生殖免疫學(xué)認(rèn)為，母-胎免疫耐受微環(huán)境失調(diào)是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要影響因素[2]；Th17和Treg細(xì)胞分別作為調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性細(xì)胞，參與了妊娠的建立與維持。兩者之間的免疫失衡可能導(dǎo)致妊娠失敗[3]。益氣補(bǔ)腎方為臨床治療RSA的有效自擬方，本團(tuán)隊(duì)前期藥理研究發(fā)現(xiàn)，該方可調(diào)節(jié)自然流產(chǎn)模型小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞、CD28細(xì)胞及NK細(xì)胞的表達(dá)；增加孕早期及中晚期脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞及Foxp3因子表達(dá)水平，并降低胚胎吸收率，但是否可調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡，維持免疫耐受而改變?nèi)焉锝Y(jié)局尚未進(jìn)行深入研究。對此，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本次研究采用自然流產(chǎn)小鼠模型，觀察益氣補(bǔ)腎方對妊娠結(jié)局、外周血Th17、Treg細(xì)胞含量、Th17/Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響，為益氣補(bǔ)腎方防治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供新的理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：SPF級雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2小鼠16只、雄性BALB/c4只，體質(zhì)量18～21g。雄性DBA/2小鼠購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]，雌性CBA/J、雄性BALB/c小鼠購于北京華阜康生物技股份有限公司[SCXK(京)2009-0004]。

1.2 藥物：益氣補(bǔ)腎方組成：黃芪36g，菟絲子30g，白術(shù)18g，當(dāng)歸6g，黨參、陳皮、升麻、柴胡各12g，中藥購于浙江省中醫(yī)院。制備：用8倍水浸泡，過夜，先煮沸30min，倒出藥液，再加入8倍水，煮沸20min，最后再加5倍水，煮沸20min，合并藥液并減壓濃縮，最后配制成益氣補(bǔ)腎方煎劑（含生藥1.6g/ml），置－20℃冰箱備用。CsA溶液：由CsA膠囊(諾華制藥，批號：S0340A；規(guī)格：25mg/粒)溶于0.1%濃度甲醇溶液[將0.1ml的無水甲醇溶于99.9ml的蒸餾水（避光保存）]制成。灌胃前2小時(shí)，將1粒CsA膠囊放入裝有25ml 0.1%濃度甲醇溶液的小燒杯中，待膠囊軟化后，用針頭將其刺破，使內(nèi)容物充分溶解于甲醇溶液，待用。

1.3 試 劑 ：CD4-FITC、PE-Cyanine5.5、IL-17A-PE、Foxp3 - APC、 RatIgG2aisoty Pecontrol-APC、RatIgG2aisoty Pecontrol-PE、Foxp3/Transcri Ption FactorStaining BufferSetKit均由eBiosci-ence公司生產(chǎn)。PMA/Ionomycinmixture、BFA/Monensin Mixture、Flowcytometry Stainingbuffer均 由 Liankebio公司生產(chǎn)。干擾素-?（IFN-?）、白介素-4（IL-4）、白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）均購于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號為70-E-EK2022。

1.4 儀器：酶標(biāo)儀（ThermoMultiskanMK3，美國）；流式細(xì)胞儀（FacsCalibur，美國BD公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國EPPendorf公司，5417R）；漩渦混合器（XW-80A型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（LDZ5-2型，北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 造模、分組及給藥：將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c組），CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立小鼠自然流產(chǎn)模型（CBA/J×DBA/2組）。每天17：30～18：00合籠，早上8：00～8：30檢查陰栓，見陰栓日為妊娠第0天；未見陰栓，則繼續(xù)合籠。每日測量孕鼠體重，觀察腹部是否有明顯隆起并及時(shí)排除假孕現(xiàn)象。最終，得到正常妊娠模型孕鼠6只，作為正常妊娠模型組（正常組）；自然流產(chǎn)模型孕鼠32只，取其中30只隨機(jī)分為自然流產(chǎn)模型組（自然流產(chǎn)組）、環(huán)孢素組、中藥高劑量組（高劑量組）、中劑量組、低劑量組，每組6只。分組完成后，正常組和自然流產(chǎn)組給予0.9%生理鹽水10ml/kg；環(huán)孢素組給予CsA 10ml/kg；中藥高、中、低劑量組分別給予48、24、12g/kg益氣補(bǔ)腎方，連續(xù)2周，每天1次。

1.5.2 流式細(xì)胞檢測外周血Th17、Treg細(xì)胞含量：連續(xù)給藥14天后，摘眼球取外周血，置于肝素鈉抗凝管中。取部分全血進(jìn)行Th17、Treg細(xì)胞含量，Th17細(xì)胞抗體標(biāo)記為FITC-抗CD4和PE-抗IL-17A，CD4+IL-17+表示為Th17細(xì)胞含量；Treg細(xì)胞抗體標(biāo)記為FITC-抗CD4、PE-抗CD25、APC-抗Foxp3，CD4+CD25+Foxp3+表示Treg細(xì)胞含量，按照試劑說明書步驟處理完成后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5.3 酶聯(lián)免疫法檢測血清Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子含量：剩余肝素鈉抗凝管中的全血，2000r/min離心10min得到血漿。采用酶聯(lián)免疫法檢測IFN-?、IL-17、IL-4、IL-10細(xì)胞因子含量，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.4 胚胎吸收率計(jì)算：末次給藥取血完畢后，迅速處死小鼠進(jìn)行解剖；用鑷子撕開子宮，記錄被吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。按下列公式計(jì)算胚胎吸收率：R=Re/(Re+F)×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)表示存活胚胎數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，計(jì)量資料采用-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)采用方差分析，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣補(bǔ)腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠胚胎吸收率的影響：與正常組相比，自然流產(chǎn)組胚胎吸收率為25.0%；連續(xù)給藥2周，與自然流產(chǎn)組相比，中藥高、中、低劑量組均能顯著減少胎盤吸收率（P＜0.05），增加胎盤存活數(shù)量；中藥各劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 益氣補(bǔ)腎方對胚胎吸收率的影響（-x±s）

2.2 益氣補(bǔ)腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠Th17/Treg細(xì)胞的影響：結(jié)果提示，益氣補(bǔ)腎方可影響自然流產(chǎn)模型Th17、Treg細(xì)胞含量，改善Th17/Treg比例失衡現(xiàn)象。見表2。

表2 各組孕14天小鼠Th17/Treg表達(dá)水平（-x±s，n=6）

2.3 益氣補(bǔ)腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子含量的影響：與正常組相比，自然流產(chǎn)組血漿IFN-?含量顯著升高（P＜0.05）；IL-4無顯著變化（P＞0.05）。連續(xù)給藥2周，與自然流產(chǎn)組相比，益氣補(bǔ)腎方中藥高、中、低劑量組均能顯著降低自然流產(chǎn)模型小鼠IL-17、IFN-?含量（P＜0.05）；中藥低劑量組IL-10含量顯著升高（P＜0.05）；中劑量組IL-4含量顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組孕14天小鼠Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子含量表達(dá)水平（-x±s，ng/ml）

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)歸屬于中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，主要病機(jī)為腎虛、脾腎兩虛、血瘀、氣血兩虛等，而脾腎二臟虧虛是滑胎的關(guān)鍵，益氣補(bǔ)腎方以補(bǔ)中益氣湯為主方，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)方化裁而成，全方具有益氣補(bǔ)腎、固攝安胎之效[4]。

生理水平的Thl7細(xì)胞具有顯著促進(jìn)胚胎成功著床的作用，Treg細(xì)胞抑制Thl7的炎癥作用，但過多的炎癥則導(dǎo)致著床失敗和反復(fù)自然流產(chǎn)。因此，任何引起Thl7/Treg細(xì)胞比例失衡的因素都可能導(dǎo)致胚胎排斥的發(fā)生。有研究者報(bào)道，通過淋巴細(xì)胞免疫治療后，可以使不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中的Treg細(xì)胞增加，而Th17細(xì)胞減少，從而改善患者體內(nèi)免疫微環(huán)境，進(jìn)一步有利于維持妊娠[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)模型小鼠外周血Th17細(xì)胞明顯升高，Treg細(xì)胞明顯減少，Th17/Treg比值明顯降低，與上述研究相一致。連續(xù)給藥2周，益氣補(bǔ)腎方可下調(diào)外周血中Th17細(xì)胞的比例，上調(diào)Treg細(xì)胞的比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移動(dòng)而誘導(dǎo)免疫耐受。

Th17細(xì)胞通過分泌IL-17、IL-21、TNF-α、IL-22等，活化MAP激酶，誘導(dǎo)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-SCF)和IL-8募集中性粒細(xì)胞，直接參與慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)[6]。Treg細(xì)胞通過直接接觸靶細(xì)胞或分泌抑制性因子如IL-10和TGF-β等抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，具有免疫無能及免疫抑制性，可降低母體對胚胎的排斥，維持免疫耐受。益氣補(bǔ)腎方下調(diào)自然流產(chǎn)模型小鼠外周血中IL-17表達(dá)水平，上調(diào)IL-10的表達(dá)水平，推測益氣補(bǔ)腎方通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞比例，改變兩者分泌細(xì)胞因子，進(jìn)一步維持免疫耐受。

Thl主要分泌?干擾素(IFN-?)和IL等參與細(xì)胞免疫，而Th2主要產(chǎn)生GM-CSF、IL-4、IL-10和IL-13等參與體液免疫，Thl7/Treg細(xì)胞對可影響Thl/Th2細(xì)胞對的免疫功能加重免疫紊亂[7]。INF-?能抑制GM-SCF在子宮內(nèi)膜的分泌，從而抑制絨毛的生長，導(dǎo)致胚胎的吸收[8]，同時(shí)，高水平的INF-?與高水平的NK細(xì)胞相關(guān)，NK細(xì)胞能非特異性地殺傷滋養(yǎng)層細(xì)胞[9]。本實(shí)驗(yàn)顯示益氣補(bǔ)腎方可降低自然流產(chǎn)模型小鼠外周血中IFN-?水平，升高IL-4水平，推測益氣補(bǔ)腎方可能通過影響IFN-?和IL-4分泌，促進(jìn)胚胎生長發(fā)育而影響妊娠結(jié)局。

本實(shí)驗(yàn)提示：益氣補(bǔ)腎方可能通過調(diào)節(jié)Th17及Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，降低Th17/Treg比例，并調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，影響Th17/Treg平衡，誘導(dǎo)妊娠免疫耐受，促進(jìn)胚胎發(fā)育，從而改善妊娠結(jié)局。

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